硝化抑制剂类型和剂量对不同类型土壤硝化抑制作用机理的研究

刘发波，郎 明，马 笑，程泰鸿，张 芬，郭广正，陈新平，3，王孝忠，3*

（1. 西南大学资源环境学院，重庆 400716；
2．西南大学农业科学研究院，重庆 400716；
3．西南大学长江经济带农业绿色发展中心，重庆 400716）

氮素是保证作物正常生长发育必需的营养元素之一，也是对作物产量和品质形成起重要作用的元素［1］。2010年以来，我国氮肥生产量年均4396万t，农用氮肥施用量年均2320万t，单位面积施用量远高于美国和欧盟水平，但氮素利用效率低于世界平均水平［2］。过量施用氮肥会造成其通过硝化-反硝化等途径损失进入环境，导致N2O排放、NO3--N淋溶损失、氨挥发、土壤酸化等一系列环境生态问题，加剧了环境污染的风险并威胁人体健康［3-5］。因此，如何减少氮肥的施用，降低环境代价风险，同时促进农作物稳产增收已经成为我国集约化农业绿色生产亟待解决的难题。

硝化抑制剂（NIs）是一类能够延缓土壤中铵态氮向硝态氮转化的化合物，延长铵态氮在土壤中存留的时间，增加土壤对铵态氮生物吸收和吸附［6-7］，因而被认为是提高氮肥利用率和减少活性氮损失的有效调控手段。尽管硝化抑制剂种类很多，但在目前的农业系统中，双氰胺（DCD）、3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）和2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（NP）是广泛使用的商业化硝化抑制剂［8］。科学家通过Meta分析表明，NIs可以提高氮肥利用率（NUE）4%～18%，减少37%～48%的氮淋洗损失以及38%～57%的N2O和NO排放［9-12］。硝化抑制剂受硝化抑制剂类型及用量、自身的理化特性、土壤与环境条件、田间管理等因素影响，不同土壤类型施用效果变异较大［13-14］。因此，要取得理想的硝化抑制效果需要适宜的硝化抑制剂类型和剂量。然而，目前的研究主要集中于针对一种土壤类型比较不同硝化抑制剂类型、不同剂量的硝化抑制效果或者针对不同土壤类型比较同种硝化抑制剂不同剂量的硝化抑制效果［15-18］。对从类型和剂量上把目前几种主要硝化抑制剂对不同类型土壤的硝化作用机理进行系统比较的研究还尚不多见。

红壤、水稻土是我国南方地区主要的土壤类型，约占全国耕地面积的2/5［19-20］，潮土是我国华北地区主要的土壤类型之一，潮土区是我国冬小麦-夏玉米作物的主要产区［21］。本研究选取了全国典型酸性土（广西红壤、安徽水稻土）、碱性土（河北潮土）开展为期28 d的静态土壤培养试验，通过比较DCD、DMPP和NP 3种硝化抑制剂及不同剂量对不同类型土壤（红壤、水稻土、潮土）硝化作用的影响，为不同土壤类型硝化抑制剂的合理应用和氮素优化管理提供理论基础和科学依据。

1.1 供试材料

供试肥料：硫酸铵（ASN），分析纯，含量99.0%，白色晶体。

供试硝化抑制剂：双氰胺（DCD）、3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）、2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（NP）。

供试土壤：广西红壤、安徽水稻土和河北潮土，以上3种类型土壤均取自农田耕作表层土壤（0～30 cm）。试验所用新鲜土样剔除杂物及残留根系，经自然风干后过2 mm筛备用，土壤基本理化性质见表1。

表1 供试土壤基本理化性质

1.2 研究方法

试验于2019年10～11月在国家紫色土肥力与肥料效益监测站进行，采用室内土壤培养方法，供试氮源为硫酸铵［（NH4）2SO4，补充含氮量］，用量为N 200 mg·kg-1，每种土壤类型设置以下处理：对照（CK），不施氮（硫酸铵）；
单施（NH4）2SO4处理（ASN）；
ASN+DCD处理，设置4个DCD用量水平，分别为施氮量的2.5%、5%、10%和 15%；
ASN+NP处理，设置4个NP用量水平，分别为施氮量的0.25%、0.5%、1%、3%；
ASN+DMPP处理，设置4个DMPP用量水平，分别为施氮量的0.5%、1%、2.5%、5%，其中添加硝化抑制剂处理施氮量与单施硫酸铵处理施氮量相同，每个处理4次重复。培养开始前将风干后过2 mm筛的土壤调节水分至40%田间持水量，而后用黑色塑料布遮盖以防止土壤水分散失，置于恒温培养箱中25 ℃、无光条件下预培养两周，使土壤活化。预培养结束后测定土壤含水量，根据土壤水分状况添加去离子水溶解硫酸铵和硝化抑制剂，均匀喷洒于土壤表面并充分混匀，装入100 mL白色塑料瓶（口径5 cm）中，每瓶装50 g，每个处理装28瓶。置于25℃的恒温培养箱培养，培养周期28 d。培养期间，每个处理都用parafilm保水透气膜包好，用针扎数个小孔以创造好气环境，相对含水量均匀保持在田间持水量的65%，风干土含水量3%计。采样7次，分别在培养后的第0、2、4、7、14、21和28 d破 坏 性 取 样。培养期间每周采用称重法补水2次，使土壤含水量保持在田间持水量的65%，并使补水后土壤充分混匀。

1.3 测定方法及数据分析

土壤pH值采用电位法测定（土水比1∶2.5）；
土壤含水量测定采用烘干法测定；
土壤有机质采用重铬酸钾氧化-容量法测定；
土壤全氮采用凯氏定氮法测定；
土壤中铵态氮、硝态氮采用0.01 mol·L-1CaCl2溶液浸提在 180 r·min-1振荡器中振荡1 h，浸提液使用 3-AA3 型（Auto-Analyzer III，Bran + Luebbe，Norderstedt，Germany）连续流动分析仪测定土壤铵态氮和硝态氮含量。

土壤表观硝化率根据下式计算：土壤表观硝化率（%）=硝态氮含量/（硝态氮含量+铵态氮含量）×100。

对试验结果采用双因素方差分析，分析土壤类型和硝化抑制剂类型对表观硝化率、无机氮含量、铵硝比的交互作用和主要影响；
采用主成分分析（PCA）确定硝化抑制剂对土壤硝化作用抑制效果的主导因素；
所有数据均采用Excel 2010、SPSS 18.0 、Origin 2018进行统计分析，采用 Duncan 最小显著极差法进行差异显著性检验（P＜0.05）。

2.1 不同类型和用量的抑制剂对不同土壤pH值的影响

由图1可知，随着培养时间的延长，ASN处理的水稻土和潮土土壤pH值明显下降，培养前后土壤pH值分别下降了1.30和0.16个单位。3种硝化抑制剂均能够延缓水稻土和潮土土壤pH值的下降，且随着硝化抑制剂浓度的增加，延缓土壤pH值下降的效果越好，至培养结束时，各剂量DCD、NP、DMPP处理水稻土的土壤pH值分别比ASN处理高0.29～0.81、0.37～0.65、0.39～0.44个单位。3种硝化抑制剂在潮土中延缓酸化的作用总体表现为：DCD＞NP＞DMPP。与ASN处理相比，3种硝化抑制剂对于红壤pH值影响差异均不显著。

2.2 不同抑制剂对不同土壤无机氮转化的影响

由图2可知，随着培养时间的延长，添加ASN处理的水稻土和潮土硝态氮含量显著增加（P＜0.05），红壤硝态氮含量培养前后无显著差异（P＞0.05）。至培养的第14 d，潮土的硝态氮含量达到峰值，而后不再增加，水稻土至培养结束时硝化作用仍在进行，表明潮土的硝化作用强于水稻土。在水稻土和潮土上，添加硝化抑制剂的处理培养期间硝态氮含量均不同程度低于ASN处理；
此外，随着DCD和NP剂量的增加，硝态氮含量明显降低，而DMPP处理无明显的剂量效应。然而，在红壤中3种硝化抑制剂处理培养前后硝态氮含量无显著差异，各剂量处理之间也无显著差异。DCD、NP、DMPP各剂量处理的水稻土在第21 d时硝态氮的平均含量分别为56.1、46.4、69.6 mg·kg-1，较ASN处理分别降低了42.8%、52.7%、29.1%，在潮土中的平均含量分别为207.3、224.8、231.8 mg·kg-1，较ASN处理分别降低了40.5%、35.5%、33.5%。

由图3可知，添加ASN处理的水稻土和潮土铵态氮含量迅速增加，而后随着培养时间的延长，水稻土中的铵态氮逐渐下降，培养结束时仍保持较高水平；
而潮土中的铵态氮第4 d迅速下降到1.2 mg·kg-1，第14 d时则完全转化为其他氮形态，红壤则随着时间的延长显著增加，且不同剂量之间无明显差异。各剂量硝化抑制剂处理的水稻土和潮土铵态氮含量均不同程度高于ASN处理，而各剂量硝化抑制剂处理红壤与ASN处理无显著差异（P＞0.05）。同一时间点，添加DCD和NP处理的水稻土和潮土铵态氮含量随着硝化抑制剂剂量的增大而增加，而DMPP不同剂量处理间水稻土和潮土铵态氮含量差异不显著（P＞0.05）。相较于ASN处理，在第14 d时，各剂量DCD、NP、DMPP处理的水稻土铵态氮平均含量分别增加了17.6、3.9、8.4 mg·kg-1，潮土的铵态氮平均含量分别增加了40.3、37.5、43.2 mg·kg-1；
至培养的第28 d时，DCD、NP、DMPP各剂量处理的水稻土铵态氮平均含量较第14 d分别为67.3、72.9、57.4 mg·kg-1，潮土的铵态氮平均含量分别为29.14、12.2、2.67 mg·kg-1。

图3 不同硝化抑制剂类型和剂量条件下红壤、水稻土、潮土中铵态氮含量的动态变化

2.3 不同抑制剂对不同土壤表观硝化率的影响

由图4可知，ASN处理的水稻土、潮土硝化作用发生强烈，在培养期间表观硝化率分别可增加到86.5%、100%，而各硝化抑制剂均可显著降低水稻土和潮土的表观硝化率。DCD和NP处理对水稻土和潮土表观硝化率均表现出较为明显的剂量效应，然而，DMPP对这2种土壤的表观硝化率均无明显的剂量效应。DCD、NP、DMPP各剂量处理的水稻土和潮土在第14 d的表观硝化率平均值分别为30.3%、82.0%、27.7%和83.0%、39.3%和80.1%。然而，在红壤上，各剂量处理3种硝化抑制剂间与ASN处理各培养时期土壤表观硝化速率没有显著变化。

图4 不同硝化抑制剂类型和剂量对土壤表观硝化率的影响

由表2可知，土壤类型和硝化抑制剂类型显著影响了土壤硝化作用。在水稻土中，DCD和NP处理的表观硝化率平均值显著低于DMPP处理，而NP处理的铵硝比显著高于DCD和DMPP处理，说明NP处理在水稻土中延缓铵态氮向硝态氮转化的能力强于DMPP和DCD处理。在潮土中，DCD处理的表观硝化率显著低于NP和DMPP处理，铵硝比显著高于NP和DMPP处理，表明DCD处理对潮土硝化作用的抑制效果优于NP和DMPP处理。利用主成分分析（PCA）分析了土壤理化性质（pH值、无机氮含量、有机质含量和碳氮比 ）和硝化抑制剂浓度等主要因素与土壤表观硝化率的关系（图5）。主成分分析筛选出2个主成分，累积方差达83.8%。土壤pH值、硝态氮含量与土壤表观硝化率存在较强的正相关，而碳氮比、有机质含量与表观硝化率相关性较弱，硝化抑制剂浓度、铵硝比与土壤表观硝化率存在负相关性。

图5 土壤表观硝化率与土壤理化性质、硝化抑制剂浓度的主成分分析

表2 不同土壤类型和硝化抑制剂类型对土壤硝化作用的影响（第21 d）

土壤pH值是调控土壤硝化过程的关键因素，先前研究表明，在pH为5.0～8.0的范围内，硝化速率与土壤pH值呈正相关［22］。土壤pH值是调控硝化抑制剂抑制硝化作用效果的主要因素（图5），在一定范围内，随着土壤pH值的增大，硝化抑制剂的作用效果越明显［23］。本研究的3种土壤中，碱性潮土的硝化作用强于水稻土和红壤，其中红壤的硝化能力最弱，进而导致3种硝化抑制剂整体上对潮土和水稻土的硝化抑制剂作用强于酸性红壤。与之前的研究结果一致［24］。在第14 d时，与ASN处理相比，各硝化抑制剂处理的水稻土、潮土表观硝化率分别降低10.1%～21.8%、17.0%～18.0%，而红壤中各硝化抑制剂处理间的表观硝化率均无显著差异。导致这一差异可能的原因是土壤pH值主导着氨氧化微生物的生态位，研究表明［25］，氨氧化古菌（AOA）主导着酸性土壤的硝化作用，氨氧化细菌（AOB）主导着中性和碱性土壤的硝化作用。Beeckman等［26］基于文献总结发现，DCD、DMPP和NP这3种硝化抑制剂对AOB的抑制效果显著高于AOA。一方面是由于AOB的丰度随着土壤环境pH值的增大被显著抑制，另一方面可能是由于基本代谢和细胞之间的差异，细菌相对古菌更容易受到抑制的影响［20］，硝化抑制剂主要通过抑制环境中主导硝化微生物菌群的生长，从而抑制硝化过程。这也可能是本研究中3种硝化抑制剂在潮土和水稻土的抑制效果要强于红壤的原因。

硝化抑制剂类型对不同土壤类型的表观硝化率和铵硝比有显著影响（表2），导致不同硝化抑制剂类型的抑制效果存在显著差异。本研究中，在水稻土中，NP的抑制效果强于DMPP和DCD；
在潮土中，DCD的抑制效果优于NP和DMPP。这与赖晶晶等［27］研究结果一致，其研究结果表明，不同硝化抑制剂类型对不同pH值紫色土硝化过程的抑制效果不一致。导致此差异的主要原因在于：一方面，大多数硝化抑制剂通过抑制硝化作用过程中第一个步骤（氨氧化过程）的氨单加氧酶（AMO）活性以实现延缓硝化作用的目的，不同的硝化抑制剂类型具有不同的硝化抑制机理［13］，因此对氨氧化微生物的作用效果也有所差异。有研究表明，DCD和DMPP属于金属螯合抑制剂，能与氨AMO中amoB亚基的活性位点铜螯合，使氨氧化微生物中AMO活性降低，进而影响氨氧化微生物的丰度和群落结构，最终抑制氨氧化过程，且该2种硝化抑制剂对AOB丰度的抑制效果强于对AOA丰度的抑制效果［26，28］。NP可直接与AMO结合产生不可逆失活的氨氧化产物，从而抑制氨氧化过程，对AOA和AOB丰度都有抑制作用，其抑制效果强弱主要取决于硝化过程主导的氨氧化微生物种群［26，28-29］。另外，硝化抑制剂的自身结构特点也是影响抑制效果的关键因素。DCD的水溶性较大，在含水量较大且保水能力较弱的土壤中，一旦遭遇强降雨会随水流失，抑制效果降低［30-31］；
NP在光照条件下易于分解，造成挥发导致抑制效果不理想，不宜表施［32］；
DMPP迁移性较小，不易与土壤剖面中的铵态氮分离，低剂量DMPP也能保持较好的抑制效果［30］。

硝化抑制剂用量是影响土壤硝化作用抑制效果的重要因素（图5），总体而言，随着剂量的增大，对硝化作用的抑制效果越明显［33-34］。DCD和NP对水稻土和潮土的硝化抑制作用表现出明显的剂量效应。然而，DMPP对水稻土和潮土的硝化抑制作用无明显的剂量效应。当DCD和NP用量分别为纯氮用量的5%～10%和0.5%～1.0%时，即可有效抑制水稻土和潮土硝态氮向铵态氮的转化。与刘倩等［34］和管西林等［35］研究结果一致。有研究表明，DMPP不同用量在大宗土壤中硝化作用的抑制效果无明显差异［33，36］，与本研究结果一致，可能的原因是DMPP在土壤中比较容易被土壤胶体吸附［30］，且在土壤剖面中不易与铵态氮分离［37］。本研究结果显示，在水稻土和潮土中DCD、NP的硝化抑制剂效果均优于DMPP，然而，一项基于全球土壤数据的整合分析表明，DMPP在中性或碱性土壤上对由硝化作用导致的硝酸盐淋洗损失降低效果要好于DCD和NP［25］，这可能与土壤质地、有机质含量等理化性质关系强烈。由于红壤pH值较低，土壤硝化作用比较弱，不同硝化抑制剂不同用量对红壤的硝化作用抑制效果均不显著，Wang等［38］的结果显示，酸性紫色土的硝化作用强度显著低于中性、碱性紫色土，而随着土壤pH值的降低，硝化抑制剂对硝化过程的抑制效果随之降低［39］。张昊青等［20］研究表明，适宜量的石灰和硝化抑制剂结合施用，不仅能够减缓酸性红壤的酸化，而且能够抑制硝化作用，降低硝态氮的潜在环境风险。

大量研究证实，在我国蔬菜［40］、水稻［41］、玉米［42］等不同作物生产系统中，氮肥配施硝化抑制剂能够提高氮肥利用率的同时增加作物产量。然而，因地域环境、气候条件的差异导致我国土壤类型众多，而硝化抑制剂的作用效果因土壤类型而大有差异，因此，要结合当地的气候条件、生态环境因地制宜的选择最佳硝化抑制剂类型，同时还应考虑剂量的大小带来的环境效益。今后的研究中应结合我国农业生产特性加强室内培养试验和大田示范性研究的结合，从微观角度进一步揭示硝化抑制剂的作用机理，加快硝化抑制剂在我国推广应用的进程。

3种硝化抑制剂均可延缓水稻土和潮土的酸化作用，对红壤pH值影响不显著。由于潮土和水稻土硝化能力强，3种硝化抑制剂均可显著抑制潮土和水稻土硝化过程中的铵态氮向硝态氮转化过程，对该2种土壤硝化作用抑制效果好，且在碱性潮土中的硝化抑制效果要优于偏中性水稻土，由于酸性红壤自身硝化能力弱而在酸性红壤中的抑制效果均不明显。DCD和NP对潮土和水稻土中硝化作用的效果有明显的剂量效应，当DCD和NP用量分别为纯氮用量的5%～10%和0.5%～1.0%时，作用效果最佳。硝化抑制剂类型对土壤表观硝化率有显著影响进而导致不同硝化抑制剂类型的抑制效果存在显著差异，在水稻土中，NP的抑制效果强于DMPP和DCD；
在潮土中，DCD的抑制效果优于NP和DMPP，这些差异可能是由不同硝化抑制剂类型硝化抑制机理的差异以及其自身特性的差异导致的。

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