白肉灵芝土传病原微生物的分离与鉴定

姚春馨，梁明泰，马渊浩，刘家迅，张绍松，陈 霞，田果廷

(1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650205；
2.云南省农业科学院园艺作物研究所，昆明 650205)

【研究意义】白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)[1]在全国的栽培起步较晚，2012年成功实现人工栽培[2]，2014年才开始有栽培报道[3]。段木埋土栽培是白肉灵芝一种重要的栽培模式，段木为灵芝的生长提供丰富的营养成分，覆土能稳定料中的湿度，维持良好的通气性。但3～5年连年栽培后容易引发严重病害、子实体畸形以及产量品质下降等类似“单一连作障碍”的现象[4]，谢荣等[5]研究发现，连作障碍甚至影响白肉灵芝总三萜质量分数的下降。近年来，云南省农业科学院生物所在云南昆明阿子营基地开展白肉灵芝-云白灵芝品种推广示范，采用“大棚内段木菌种埋入并覆土多年多茬采芝”的栽培模式，该模式不仅低污染、易控制、产量高，还能节省物料和人工成本，其子实体多糖、总三萜含量较高，经济效益显著。针对其连作障碍出现的病原性和生理性病害，目前采用换新土的方式，连作障碍严重造成土地资源浪费和成本增加，同时也制约了云南白肉灵芝产业的可持续发展。【前人研究进展】连作障碍主要因素包括土壤生物、物理和化学因子的改变，土壤微生物种群特性的变化，作物根部产物的自毒作用，以及某些致病菌的增殖[6-7]。马红梅等[8]采用选择性培养基计数三大主要微生物类群，证实连作使灵芝土壤微生物区系的结构和数量发生了改变。灵芝连作的主要病原菌有青霉、绿霉、曲霉、毛霉、链孢霉等[9]。黄鑫伟等[10]确定了引起灵芝绿霉病的病原菌为侧耳木霉。灵芝黄腐病是导致灵芝减产的主要病害，子实体不形成或仅有少量形成，芝盖畸形[7]，该病原菌通过栽培土壤传播危害巨大[11-13]，灵芝腐败木生红曲霉菌也是其中之一[14]。【本研究切入点】当前相关灵芝属连作障碍的研究报道主要集中在低海拔沿海地区适宜高温高湿环境条件的赤芝(G.lingzhi)这一物种。本项目以自主育成的极具高原特色的中低温型灵芝品种-白肉灵芝(G.leucocontextum)为材料，以段木埋土栽培的连作障碍为科学问题，试图通过原位筛选优势菌开展土传病原菌的分离。【拟解决的关键问题】本研究分析不同栽培年限土壤三大微生物类群的变化，以土壤稀释培养法分离白肉灵芝连作土优势微生物，并采用平板对峙试验筛选白肉灵芝潜在的土传病原菌，对探究段木埋土栽培白肉灵芝的病害防控具有重要的实践和理论意义，还能为解决灵芝生产的连作障碍提供一定的理论依据。

1.1 供试材料

1.1.1 土样 2021年9月白肉灵芝子实体采收结束后采集土壤样本，以基地内未栽灵芝的大棚内土壤作为对照[处理T0(CK)]，选取段木埋土栽培模式下的不同年限：连栽1年(处理T1)、3年(处理T3)、5年(处理T5)，共4组覆土层土壤。每组随机选5个采样点，除去表土，采集深度3 cm、直径5 cm范围内的土壤，组成混合土样200 g。全部样本均4 ℃低温保藏，24 h之内进行后续处理。

1.1.2 培养基 细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，放线菌采用高氏一号培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物分离 称取1 g土样用无菌水梯度稀释，取10-3、10-4、10-5稀释液0.1 mL，设3个重复涂布于培养基表面，倒置放入37 ℃(细菌)和28 ℃(真菌、放线菌)恒温培养箱培养。细菌培养24 h，长出单菌落；
真菌培养3～5 d；
放线菌培养5～7 d。记录各平板的菌落总数，计算不同土壤样品每克的菌落数。选取来源于处理T3、处理T5连作土的土样培养平板，挑单菌落划线纯培养，做优势菌的分离。

1.2.2 优势微生物的鉴定 菌株纯化后，观察优势微生物的微宏观表型特征，包括细菌、放线菌和真菌的菌落和菌体形态。细菌采用革兰氏染色，显微观察菌体个体形态并分类。各菌种经纯化，用TSINGKE植物DNA通用型试剂盒提取基因组DNA并保存。采用细菌通用引物16s 27F/1492R、真菌通用引物 ITS1/ITS4 对供试菌株分别扩增。PCR 引物合成和扩增产物测序由擎科生物(昆明)完成，序列经双向测通并拼接处理，在NCBI上进行比对，并选择最大相似序列用来建树。利用Clustalx进行多序列比对，结果导入MEGA 6.0软件进行聚类分析并构建系统聚类树图。结合形态学及生理学特征，确定菌株物种。

1.2.3 可培养土传病原菌的拮抗性筛选 以白肉灵芝YGL6菌株为指示菌，将分离的细菌、放线菌、真菌各菌株采用平板对峙培养法进行拮抗性试验，开展白肉灵芝土壤潜在致病菌的筛选。用直径为6 mm的打孔器取生长良好的YGL6菌株，接入PDA平板一侧，于24 ℃恒温培养箱中培养3 d。取培养后生长良好的灵芝平板，处理组在距灵芝菌块边缘3 cm处划线接入活化24 h的病原菌，不接病原菌的作为对照组，3次重复。24 ℃恒温继续培养，第5天开始采用十字交叉划线法测量菌落直径，连续测量10 d，获得菌丝的日均长速(mm/d)，按下式计算抑菌率以测定病原菌对灵芝菌丝生长影响。

抑菌率(%)=[(对照菌落长速-处理菌落长速) / 对照菌落长速]×100

1.2.4 统计方法 采用统计软件SPSS Statistics 19.0 对数据作显著性检验，WPS进行作图分析。

2.1 不同栽培年限白肉灵芝土壤三大微生物类群差异

白肉灵芝覆土层土壤可培养微生物计数结果显示，不同栽培年限的覆土层土壤可培养的细菌、放线菌、真菌的数量和占比差异显著。处理T1的微生物数量最多，且细菌、放线菌、真菌数量均较多，与处理T0(CK)相比，总数增长近2.6倍。处理T3、处理T5的微生物数量则小于处理T0(CK)，随着连作栽培年限的延长，主要微生物数量有下降趋势，特别是放线菌，处理T3降幅达77.11%，处理T5未检出；
细菌下降30.37%～51.90%；
真菌降幅不明显。

如图1所示，处理T1与处理T3三大微生物类群占比无明显差异，细菌与放线菌接近1∶1，与处理T0(CK)相比，放线菌占比下降近26%。随着连作栽培年限的增加，三大微生物类群占比以放线菌优势趋于细菌优势，细菌占比逐年增加，放线菌占比逐年下降，真菌占比最少但逐年增加。

图1 白肉灵芝土壤可培养微生物三大类群占比Fig.1 The proportion of three groups of culturable microorganisms in G. leucocontextum soil

2.2 白肉灵芝覆土层土壤优势微生物种群分析

2.2.1 各菌株形态与生理特征 连作土中分离到14个优势菌落做纯培养，进行微宏观形态观察。

N2在PDA平板上菌落黏质生长，形态不规则，边缘不整齐，中间呈沟壑状凸起，气生菌丝，分支有隔。N3在PDA平板上菌落平坦，中央呈橙黄色，外围呈白色，生长过程出现同心圆，质毡状，分枝状气生菌丝，内有隔。N4在PDA平板上菌落较大，圆形，中间青灰色，边缘白色；
气生菌丝，菌丝偏细，呈帚状分枝，卵型孢子。N5在PDA平板上菌落正面平展，毛毡状，边缘较稀疏，菌落反面呈淡黄色，有向心褶皱及半透明螺纹，菌丝呈半透明状，具少量小而光滑孢子囊。N7在PDA平板上菌落呈绒毛状，双轮生，中后期呈四层，由内到外为青橙黄白。菌丝分支，有膈，呈典型帚枝状，顶端孢子放射式生长。

图2-b 中9个优势细菌菌株：N1在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈毛毡状、絮状或绳索状，菌落初生白色，后变为灰色，分生孢子梗分支。N6菌落呈同心圆生长，菌体灰白色，中间褶皱，呈放射状向外生长，外缘整齐，菌丝偏细，帚状分枝。N8菌落圆形生长，质地粘稠，边缘光滑，中心淡黄色，边缘乳白色，革兰氏阴性，杆状，菌体较小。N9菌落呈短绒状生长，质地干燥，白色，边缘有淡黄色物质溢出，气生菌丝，稍短，菌丝枝状，未见隔。N10菌落呈圆形，边缘呈花边状，中间隆起，质地干燥，菌丝白色，后期转灰褐色，放射状气生菌丝。N11在平板上不规则生长，菌落乳白色，光滑不透明，边缘有小凸起，基生菌丝，菌丝有分支。N12菌落扁平，灰白色，表面无光泽，略微干燥，边缘不规则，四周皱褶隆起，革兰氏阳性，菌体短杆状，呈圆形或椭圆形。N13在平板上不规则生长，菌落呈褶皱状，不透明，边缘不光滑，革兰氏阳性，短杆状，内生芽孢。N14在平板上不规则生长，菌落呈褶皱状，不透明，边缘不光滑，革兰氏阳性，杆状，芽孢内生。

a.5个优势真菌；
b.9个优势细菌a.Five dominant fungal species; b.Nine dominant bacterial species图2 优势菌菌落形态Fig.2 Colony morphology of the dominant microorganisms

部分真菌菌株的菌丝结构如图3所示；
细菌则进一步进行革兰氏染色等生理生化鉴定，部分菌株的染色结果如图4所示。

图3 优势真菌显微结构Fig.3 Microscopic structure of dominant fungal species

图4 细菌芽孢Fig.4 Some bacterial spores

2.2.2 各菌株的分类鉴定 各菌株DNA扩增子测序经GenBank序列比对，基于最大相似法进行聚类分析，MEGA构建14个菌株与近似物种的系统进化树图(图5)。各菌株与最相似模式物种遗传距离极近，表明测试菌株与模式菌株对应序列具有极大的相似度，物种鉴定可信度高；
步长检验显示，14个菌株间遗传距离较远，在较低的相似度水平所有菌株分成细菌与真菌2个组，组间遗传距离较远，说明具有较大的遗传差异。

图5 14个菌株及近似种的NJ聚类Fig.5 Dendrogram of 14 strains and related species

根据分子生物学鉴定结论，结合供试菌株的微宏观表型特征、生理生化试验等形态分类结果，得出优势菌株的物种鉴定。从表1可见，9个细菌菌株中有4株链霉菌属、3株芽孢杆菌属Bacillussp.、1株贪铜菌属和1株红球菌属；
5个真菌菌株则分属不同属。

表1 菌株测序克隆序列与其 GenBank 最相似序列的比对

2.3 白肉灵芝土传病原菌的筛选

采用对峙试验法，将白肉灵芝YGL6与14个优势菌在 PDA 培养基上培养，与对照组比较，部分处理组白肉灵芝菌落直径差异明显(图6)。

图6 部分土壤微生物与白肉灵芝菌丝间的对峙实验Fig.6 Experiment of confrontation between some soil microorganisms and G. leucocontextum mycelia

覆土微生物中分离到N7、N11、N9、N12、N13、N14共6个菌株，对照组与处理组差异显著(P<0.05)，抑菌率高达80%以上(表2)。综合菌株鉴定结果，覆土微生物种群中的芽孢杆菌属(Bacillussp.)、篮状菌属(Talaromycessp.)、红球菌属(Rhodococcussp.)和部分链霉菌属(Streptomycessp.)可能是白肉灵芝连作中的土传病原菌。其中，N7菌株[篮状菌属(Talaromycessp.)]是真菌，其他几个抑制菌为细菌。

表2 土壤微生物对白肉灵芝菌丝生长的影响

3.1 白肉灵芝连作栽培对土壤三大微生物数量的影响

目前食用菌连作障碍的研究主要集中在栽培土壤方面，土壤环境或培养基质中微生物显著影响食用菌的生长发育[15-17]，土壤微生物是生长发育过程中的重要参与者，是土壤生态系统中关键的构成要素。土壤微生物区系变化及其数量的增减通常是评价土壤质量的一个指标[18]。土壤微生物区系的失衡与连作障碍联系密切。连作改变了土壤细菌、真菌和放线菌群落结构，与土壤的生物、物理、化学特性的变化一同形成了特殊的环境，因此解析连作覆土中微生物群落的变化对防治连作障碍具有重要指导意义。余世金等[19]研究表明，茯苓栽培前后土壤微生物总数下降，其中细菌数量增加2.3%，放线菌和真菌则分别降低52.6%、66.8%。目前，还有许多研究发现，在竹荪[20]、灵芝[21]等食用菌连作栽培后，土壤菌群逐渐由“细菌型”向“真菌型”变化。本研究中白肉灵芝段木埋土栽培后，随着连作年限的增加，土壤可培养微生物数量和种群发生变化，除了连作1年土壤中细菌、放线菌、真菌数量增长之外，连作3年、5年后细菌、放线菌的数量下降趋势明显，真菌数量逐年增加，表明灵芝连作栽培使土壤中由细菌参与的营养分解与转换等代谢减少，由真菌引起的次生代谢物等病源物增加，这与大多数作物生产连作障碍的“营养减少、病虫害增加”的症状表现一致。三大主要微生物类群中，细菌占比与真菌占比逐年增加，放线菌逐年下降，表明白肉灵芝段木埋土的连作栽培影响了区域内土壤的微生态，导致土壤理化失衡，有效营养降低。针对白肉灵芝连作土壤微生物区系的物种结构、多样性分析等，则需要借助扩增子测序等技术开展深入研究。

3.2 对白肉灵芝菌丝生长具抑制作用的土传病原菌

Kang等[22]基于形态学和系统发育树分析，发现木霉属与灵芝连作的黄腐病有关；
马红梅等[6]发现大田优势菌群[如梭菌属(Clostridium)、产碱菌属(Alkaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)等]对连作障碍灵芝菌丝体有较强的化感作用；
袁源等[23]通过Illumina MiSeq平台分析灵芝连作覆土中真菌和细菌群落的变化，认为青霉属可能是引发灵芝连作障碍的重要菌群，而覆土中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、脱氯菌属(Dehalococcoides)等有益细菌相对丰度下降与灵芝连作障碍有关。可见，灵芝连作障碍与土壤基质中微生物的变化具有明显的相关性。采用实验室可培养方式在白肉灵芝覆土层土壤中分离的优势微生物中，能抑制白肉灵芝菌丝生长的多个菌株为芽孢杆菌属(Bacillussp.)、篮状菌属(Talaromycessp.)、红球菌属(Rhodococcussp.)和部分链霉菌属(Streptomycessp.)。

本研究分离到的这一抑菌型真菌菌株N7，篮状菌属(Talaromycessp.)广泛应用于工业、医药和农业，作为生物防治的微生物能帮助植物对抗病原菌，产几丁质酶，从而抑制黄萎病菌、核盘菌和立枯病菌的细胞壁生成，并且还能抑制链格孢菌、镰刀菌和稻瘟病菌的孢子萌发和菌丝伸长，其次级代谢产物及抑菌活性研究相继开展[24-25]。平板上与白肉灵芝菌丝的对峙试验也证实了该菌株的抑菌性。

芽孢杆菌(Bacillussp.)为产孢杆菌，属于好氧性细菌，对土壤的肥力有影响，解磷解钾功效显著，常被用来生产生物有机肥[20]。其中，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)抗逆性强，其耗氧、产枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质；
解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)在生长过程中也产生一系列能抑制真菌和细菌活性的代谢物；
贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，亦具有广谱抗菌活性。芽孢杆菌产生的抗菌物质主要有抗生素、抗菌蛋白等，抑菌机理主要包括拮抗、竞争、溶菌、诱导系统抗性等方式[20]。芽孢杆菌在农业生产上有促进植物生长和抵御病原微生物作用，成为动植物生产中的一类益生菌。在食用菌的栽培中，张月珠等人研究发现，巨大芽孢杆菌对竹荪菌丝生长具有明显抑制作用[26]，本研究中芽孢杆菌属的多个菌株在灵芝栽培上也表现抑制生长的特性，这可能与其生长过程中分泌的几丁质酶等抑菌物质抑制了大型真菌菌丝体的生长有关。另外，芽孢杆菌作为生防菌的一类，其中的短小芽孢杆菌对灵芝哈茨木霉病害又有较好的抑制作用[27]，因此，要确认芽孢杆菌属不同物种对白肉灵芝是否有抑制作用，在栽培生产上是否成为病原菌则需要进一步深入研究，多方面综合研判。

本研究中红球菌属(Rhodococcussp.)菌株和部分链霉菌属(Streptomycessp.)菌株对白肉灵芝菌丝体的生长显示为抑制，这与大部分放线菌对于真菌的抑菌作用结果一致[28]。邱孜博等[29]研究认为，红平红球菌(R.erythropolis)含有独特的细胞壁结构、大型基因组与环状质粒，可分泌大量活性酶，因其脱硫作用而被应用于环境污染物的降解。在与灵芝菌丝体的对峙培养中表现抑菌作用，可能与该菌合成或转化形成的化合物影响了灵芝生长有关。纤维黄链霉菌(S.celluloflavus)则是纤维素酶与几丁质酶的高产菌株，直接影响了白肉灵芝的正常生长[30]。

值得注意的是，白肉灵芝本身作为大型真菌的一种，参与了有机质的分解与合成，在土壤碳代谢和氮循环中起着重要作用。虽然放线菌大多产抗生素类物质，作为生防菌广泛应用于农业生物防控；
芽胞杆菌能提高土壤肥力并有效抑制病原菌生长，成为广谱益生菌。但是在灵芝栽培中，土壤中的微生物与灵芝争夺营养，次生产物抑制菌丝生长从而影响灵芝的产量和品质，提示灵芝等食用菌的生产过程中不能盲目施用益生菌、生防菌等生物药肥。针对主要病害与防治还需进一步分离和鉴定致病菌，通过毒力测试等手段筛选杀菌剂和重点防控措施[31-32]。

白肉灵芝连作显著影响了覆土微生物区系，不同栽培年限的土壤三大微生物种群差异显著，可培养微生物数量和种群发生变化，随着栽培年限的增长，连作土壤中细菌、放线菌数量下降趋势明显，真菌数量逐年增加。三大主要微生物类群中，细菌占比与真菌占比逐年增加，放线菌则反之。

白肉灵芝连作土分离的优势微生物中，筛选到能抑制灵芝菌丝生长的多个菌株，认为微生物种群中的芽孢杆菌属(Bacillus)、篮状菌属(Talaromyces)、红球菌属(Rhodococcus)和部分链霉菌属(Streptomyces)菌株可能是白肉灵芝段木埋土栽培连作障碍中潜在的土传病原菌。不过，进一步确定灵芝连作障碍的土传病原微生物，还需结合不同的菌株特性，经化感试验、生产验证等深入研究作出综合评估。

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