草鱼TBK1基因荧光定量PCR检测方法的建立

张林，张浪，周剑光，甘金华，张涛，何力

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心，湖北 武汉 430072)

草鱼(Ctenopharyngodonidella)是鲤科、草鱼属鱼类。草鱼是典型的草食性鱼类，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。性活泼，游泳迅速，常成群觅食。草鱼幼鱼期则食幼虫、藻类等，草鱼也吃一些荤食，如蚯蚓、蜻蜓等。分布广，在中国分布于黑龙江至云南元江(西藏、新疆地区除外)。已移殖到欧、美、非等各洲，是世界上广泛养殖，且产量最高、最重要的淡水经济鱼类之一[1]。草鱼也是中国重要的淡水养殖鱼类，其和鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)一起，构成了中国的“四大家鱼”。然而，草鱼容易被病原体感染，如呼肠孤病毒(Reovirus)感染，一旦感染，发病率和死亡率极高[2]。干扰素(Interferon，IFN)是一种重要的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌及免疫调节等多种作用[3]。作为干扰素调节因子(Interferon regulator factors, IRF)活化所必须的磷酸激酶，TNF受体相关因子(TNF Receptor-associated factor, TRAF)家族成员相关的NF-kB活化因子(TANK)结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)，在Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)、RIG-I样受体(RIG-I Like Receptors, RLRs)以及胞浆DNA受体介导的抗感染天然免疫中发挥核心枢纽作用，TBK1活化后可诱导下游的IFN调节因子 3/7(IRF3/7)活化并激活I型干扰素的表达，启动后续信号传导，抵御病原体浸染[4-5]。开展动物干扰素的研究，建立动物干扰素功能相关基因检测方法，特别是反应机体天然抗病免疫功能的TBK1基因的准确定量检测，可用于动物病原体感染、机体免疫系统激活的早期监测，对于动物疫病的防控起到重要作用。

目前，关于基因检测方法有RT-PCR[6]、Northern blot[7]、Real-time PCR[8-9]、融合荧光蛋白[10-11]、报告基因等[12-13]。其中qRT-PCR在养殖动物基因或微生物中应用广泛[14-15]，特别在评价机体基因表达水平的qRT-PCR方法，由于其敏感性和特异性强，能准确检测微量mRNA水平，应用更为广泛。但由于RNA存在质量及反转率效率差异等问题，一般选择基因序列高度保守、mRNA表达数量高、稳定表达于不同组织细胞中的18SrRNA作为内参基因进行校正和标准化[16]。

目前关于TBK1[17-18]的实时荧光定量PCR检测技术，在人和鸡的天然抗病免疫中已有报道[19]，然而TBK1在硬骨鱼中研究较少。草鱼TBK1基因研究报道很少，主要是克隆及免疫调控方面研究[19-20]，其定量检测方法未见报道。因此本研究以草鱼的18SrRNA作为内参基因，建立了草鱼TBK1的实时定量PCR检测方法，为研究草鱼病原体感染后天然抗病免疫功能的激活、草鱼疫病感染的早期检测及草鱼TBK1基因的动态变化规律提供基础数据。

1.1 主要仪器与材料

本研究中实验动物草鱼(体重40～50 g，体长15.28～16.20 cm)来自长江水产研究所梁子湖实验基地。

本研究所用试剂主要包括：Trizol(Invitrogen 公司)，异丙醇、三氯甲烷、无水乙醇(国药集团)，Taq DNA 聚合酶、RNase 抑制剂、DNAseⅠ、dNTP、DEPC(TaKaRa生物科技有限公司)、RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas 公司)，ChamQ SYBR qPCR Master Mix荧光定量试剂盒(Vazyme公司)，Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、琼脂糖、蛋白胨、酵母浸粉、TAE 缓冲液、核酸染料、DNA Maker、Plasmid Mini Kit(Tiangen公司)，pMD18T 载体、DH5a大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

本研究所用的仪器设备主要包括：PCR 基因扩增仪、CFX96 荧光定量 PCR 仪、凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad 公司)，台式高速离心机、可调式微量移液器(2.0 μL、10.0 μL、100.0 μL)(Eppendorf公司)，DYCP-31型水平电泳仪、涡旋混合仪、HZP 型振荡培养箱(北京六一)，超净工作台，通风橱、常规冰箱、超低温冰箱(Thermo Fisher 公司)。

1.2 引物的设计与合成

通过Prime 6.0软件，以National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中公布的草鱼TBK1序列为模板，设计2对草鱼TBK1基因PCR检测引物，以草鱼的18SrRNA作为实时定量PCR的内参基因，所设计的引物由上海生工股份有限公司合成，引物序列信息见表1。

1.3 PCR扩增及ciTBK1引物验证

将所取的草鱼肾脏、脾脏组织用液氮低温研磨处理，利用Trizol 等试剂采用经典的方法提取RNA，用RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas公司)进行反转录扩增，获得cDNA，作为后续PCR扩增的模板，利用表1中的引物，进行特异性PCR扩增，获得目的基因片段。PCR产物经琼脂糖电泳进行鉴定，并回收鉴定正确的基因片段进行测序分析，验证所设计引物的准确性。

1.4 标准品的制备

凝胶回收测序验证正确的草鱼TBK1及18SrRNA基因片段，与 pMD18T载体连接，将连接产物转化DH5a感受态细胞，通过氨苄抗性筛选，选取2～3个单克隆接种含氨苄的液体LB培养基培养12～16 h，用质粒提取试剂盒提取阳性质粒，并将所提取质粒进行测序，将测序正确含有目的基因的重组阳性质粒命名为pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA，该阳性质粒可作为后续荧光定量PCR检测的标准品。

1.5 定量PCR检测方法的建立

1.5.1 定量PCR反应条件优化

以反转录获得的草鱼cDNA作为模板，按照荧光定量PCR试剂盒说明书推荐的反应体系进行PCR扩增，以每个反应中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，即Ct值来评判扩增效果。以熔解曲线峰单一、无非特异性扩增和Ct值最小为标准，对模板浓度、引物浓度、退火温度、反应时间及循环数等反应条件进行优化，确定PCR反应最优条件。

1.5.2 标准曲线的制备

测定pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA标准品的浓度及纯度，换算方法参考Li等[17]建立的TBK1突变检测的方法。将制备的标准品进行10倍倍比稀释，以101～106拷贝/μL的不同浓度标准品为模板进行PCR扩增，每个样品设置3个平行，同时设置以去离子水为模板的空白对照。标准曲线是以模板数的对数为x轴，循环数Ct值为y轴，建立定量PCR反应的标准曲线。

1.5.3 定量PCR反应的敏感性、特异性及重复性验证

用优化建立的qRT-PCR方法扩增ciTBK1基因，通过qRT-PCR熔解曲线中扩增曲线峰单一且无杂峰来表明设计的引物特异性较强，反应条件恰当，以此确定qRT-PCR扩增反应的特异性。以10倍倍比稀释的101～106拷贝/μL的标准品为模板，进行qRT-PCR和常规PCR扩增，比较2种方法能够检出的最低模板浓度，评价定量PCR方法的灵敏性。选取1×102、1×104、1×106拷贝/μL 3个浓度的标准品为模板进行PCR扩增，进行组内重复性检验，同时在3个不同时间点进行组间重复性检验。计算定量PCR反应Ct值的平均数和变异系数，评价定量PCR反应的重复性。

2.1 ciTBK1定量PCR引物的确定

本试验针对草鱼TBK1基因所设计的2对引物均可扩增得到大小与预期相符的目的基因条带(图1)，且扩增产物经测序分析发现与已报道的草鱼TBK1基因序列一致。其中引物1进行PCR反应，所扩增条带特异性更好，因此本研究选取引物1作为后续定量PCR检测引物。

图1 不同引物扩增ciTBK1及18S rRNA的PCR扩增基因条带1：ciTBK1(引物1扩增)；
M：DNA标准DL2000；
2：ciTBK1(引物2扩增)；
3：18S rRNA。Fig.1PCR amplification of ciTBK1 and 18S rRNANote:1:ciTBK1(primer 1 amplification);M:DNA standard DL200;2:ciTBK1(primer 2 amplification);3:18S rRNA.

2.2 定量PCR反应标准品的制备

提取测序验证正确的阳性克隆质粒pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA，并测定其浓度，作为后续定量PCR反应的标准品，-20 ℃保存备用。重组阳性质粒pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA的拷贝数分别为5.40×107拷贝/μL和1.28×108拷贝/μL。

2.3 定量PCR反应条件的确定

通过对引物浓度、退火温度及循环数等定量PCR反应条件优化，最终确定20 μL PCR反应体系如下：模板2 μL， 上、下游引物(2 μmol/L)各1 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件为：95 ℃，1 min；
95 ℃，10 s;60 ℃，30 s;共40个循环。

2.4 定量PCR标准曲线的构建

从PCR反应的扩增曲线分析：ciTBK1和18SrRNA的定量PCR扩增曲线间距均匀，熔解曲线单一无杂峰。根据浓度对数值与Ct值之间的关系，确定ciTBK1和18SrRNA表达量的回归方程分别为：

2.5 特异性、敏感性及重复性试验

特异性试验表明：在相同的反应条件下，以pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA质粒为模板能扩增到正常曲线和特征性熔解曲线峰，ciTBK1和18SrRNA扩增反应的退火温度Tm值分别为(80.0±0.2) ℃ 和 (82.0±0.2) ℃，PCR反应无非特异性扩增，扩增产物单一(图2)。

图2 ciTBK1及18S rRNA荧光定量PCR扩增的特异性试验注：图中 a、b峰型分别代表pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18S rRNA.Fig.2Specificity assay of qRT-PCR for detection of ciTBK1 and 18S rRNANote:a:pMD18T-ciTBK1,b:pMD18T-18S rRNA.

敏感性试验表明：以101～106拷贝/μL的pMD18T-ciTBK1质粒为模板进行检测，普通PCR反应检测下限为103拷贝/μL(图3a)，而荧光定量PCR反应检测的下限为101拷贝/μL (图3b)，荧光定量PCR反应检测下限明显高于普通PCR反应，灵敏度较常规PCR高100倍。

图3 ciTBK1检测的敏感性试验注：3a:ciTBK1荧光定量PCR检测的敏感性试验；
3b:ciTBK1普通PCR检测的敏感性试验。Fig.3Sensitivity assay for detection of ciTBK1Note:3a: Sensitivity assay of qRT-PCR for detection of ciTBK1；
3b: Sensitivity assay of ordinary-PCR for detection of ciTBK1.

以3个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验，由表2可知，组内及组间重复的变异系数分别为0.25%～0.59%、0.37%～0.49%，所建立的定量PCR检测方法重复性好。

表2 ciTBK1荧光定量PCR扩增重复性试验Tab.2 Repeatability assay of qRT-PCR for detection of ciTBK1

本研究建立的草鱼TBK1基因实时荧光定量PCR检测方法采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒，该产品中含有 SYBR Green I荧光染料，通过SYBR Green I与dsDNA非特异性结合，实时监测随着PCR扩增产物的增加荧光强度的变化情况，并通过熔解曲线排除非特异性干扰[14]。

本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有检测成本低、检测方法简单快捷的特点。整个PCR检测过程可实时监测，自动化程度较高，避免了交叉污染的可能，可进行直观的定量分析。本研究结果表明，目的基因和内参基因的扩增曲线间距均匀，特异性强，熔解曲线单一无杂峰，标准曲线线性关系良好；
同时检测下限可达50 拷贝/μL，检测方法的敏感性高，是常规PCR的100倍；
所建立的检测方法组内和组间变异系数均在0.6%以内，重复性和稳定性良好。

综上所述，本研究建立的草鱼TBK1基因的实时荧光定量PCR检测方法可实现对草鱼TBK1表达水平快速定量检测；
本检测方法通过18SrRNA内参基因的校正，可消除采样、RNA提取及反转录等过程中的操作误差，且具有特异性强、灵敏度高、重复性好和操作简便等诸多优点，可作为一种快速、灵敏、准确的草鱼体内TBK1基因表达监测的有效方法，应用于实际生产中草鱼感染的早期监测，为草鱼疫病防治提供技术支持。

猜你喜欢草鱼定量特异性见证！草鱼再次崛起当代水产(2022年7期)2022-09-20草鱼出血病的研究进展及免疫防治当代水产(2022年3期)2022-04-26管家基因突变导致面部特异性出生缺陷的原因中国生殖健康(2020年2期)2021-01-18显微定量法鉴别林下山参和园参世界科学技术-中医药现代化(2020年2期)2020-07-25草鱼价格上涨，饲料、苗种、养殖、流通接下来会如何变化?草鱼要雄起了吗?当代水产(2019年9期)2019-10-08当归和欧当归的定性与定量鉴别中成药(2018年12期)2018-12-29屋檐下的小草鱼广东第二课堂·小学(2018年9期)2018-10-2410 种中药制剂中柴胡的定量测定中成药(2017年6期)2017-06-13精确制导 特异性溶栓中国医疗保险(2017年5期)2017-05-17重复周围磁刺激治疗慢性非特异性下腰痛的临床效果中国康复理论与实践(2015年10期)2015-12-24