分子改造后酶法合成功能性低聚半乳糖的研究进展

李冠洋， 金 清

(1.延边大学 融合学院；
2.延边大学 农学院：吉林 延吉 133000)

随着人们日益增长的饮食需求，越来越多的食物逐渐进入到大众的餐桌[1]。这导致了机体对具有高胆固醇、高油脂食物的摄入量增加。致使膳食结构发生改变，直接增加了疾病发生的可能性。

近年来，公众对营养的意识有所提高[2]，对明显有益健康食品的需求量也在增加[3-4]。目前消费者对被认为具有低热量、低脂肪、低糖的食品更加热衷[5]。

益生菌与人类的身体健康有着紧密的联系。益生元被定义为“一种有选择性的发酵成分，允许胃肠道微生物群，例如乳酸菌和双歧杆菌属等发生特定的变化后，给宿主的健康带来好处的一类物质。其中，低聚半乳糖(Galactooligosaccharide，GOS)属于益生元，是近年来备受关注的功能性低聚糖，并且是众多功能性低聚糖中最受大众所接受的，最安全的低聚糖之一，也是具有益生特性的低聚糖[6]。2007年6月29日我国发布第12号公告，将GOS确定为营养强化剂；
2008年9月9日卫生部又发布了第20号公告，将GOS定义为新资源食品，并规定GOS可广泛应用于婴幼儿配方食品、各类食品和营养保健品；
2008年7月28日美国FDA发布了GRAS公告(公告号GRN000236),确认GOS为公共安全性物质，其应用遍及各类婴幼儿配方食品。

我国目前制备GOS的方法主要以酶法提取为主，β-半乳糖苷酶与乳糖发生转糖苷反应时生成GOS。这种方法虽然安全但却不高效，所以要对这些天然来源的酶进行分子改造，改造的方向可以是定向的也可以是随机的，根据需要增强其某一方面的特性，更好的满足人们需要。

1.1 低聚半乳糖结构

低聚半乳糖是以乳糖为底物，通过β-半乳糖苷酶作用，生成由2～10个半乳糖基和1个末端葡萄糖基通过糖苷键连接而成的低聚糖[7-10]。

因β-半乳糖苷酶的来源不同，导致其糖苷键的连接方式也不相同。结构式为(Galactose)n-Glucose(图1)。

图1 低聚半乳糖的结构式

1.2 理化性质

低聚半乳糖是一类无法被胃肠道所消化吸收的功能性低聚糖，可以直接进入肠道，为以乳酸菌为主的肠道微生物供给原料，具有益生特性[11-12]。

低聚半乳糖被发现广泛存在于哺乳动物乳汁中，但存在量极少；
人类母乳中的量相对多一些，所以也被称为乳源功能性低聚糖；
在一些水果蔬菜，如洋葱、大蒜和大豆中也天然存在，然而，这些食物中的含量较低，存在的益生效果并不明显[13]。因此，低聚半乳糖最佳的补充形式是采用营养补充剂或在食品中直接添加。

低聚半乳糖也拥有优良的热稳定性，在120 ℃条件下可以保存30 min；
同时，其耐酸性也很高，能够在人体的肠道中长时间存在，促进双歧杆菌等益生菌的生长。

低聚半乳糖属于非消化性低聚糖(NDO)，也被认为是水溶性膳食纤维[14]，是β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生成的益生元[15]；
被宿主肠道微生物选择性利用，促进宿主的健康。由于低聚半乳糖在肠道前端不能被水解或吸收，仅部分能被肠道中的益生菌分解产能，因此，低聚半乳糖的能量值相当低，约为1.73 kcal/g[16-17]。且甜味纯正，具有高度的水溶性和适口性，甜度约为蔗糖的20%～40%，可作为低热值的食品添加剂[18]。低聚半乳糖还具有促进肠道健康，增加人体免疫力和抗龋齿等特性[19]。

3.1 低聚半乳糖的合成途径

由图2可知，β-半乳糖苷酶对乳糖的水解反应和转糖苷反应是同时进行的，与大多数的糖苷酶(Glycoside Hydrolase，GH)一样，它们的转苷机制包括糖基化与去糖基化2部分[20]。1) 糖基化反应包括：乳糖大分子中的糖苷键在β-半乳糖苷酶中酸碱氨基酸及亲核氨基酸的作用下发生断裂，生成半乳糖分子，同时会与酶中的亲核氨基酸结合，形成酶与半乳糖的中间复合体；
2) 去糖基化反应包括：中间复合体会发生水解，在生成半乳糖的同时与周围的乳糖分子或单糖分子进行转苷反应，生成低聚半乳糖[21]。

图2 低聚半乳糖的合成途径

3.2 低聚半乳糖的制备方法

3.2.1 提取法

在已知的水果和蔬菜中如草莓、香蕉、大豆、大蒜等，虽然都含有低聚半乳糖，但其中的含量都极低，而且都以多糖的形式存在，其中不乏其他的功能性低聚糖及其他糖类物质，在分离纯化的过程中存在着杂质多，特异性低等困难,使得从多糖中提取唯一的低聚半乳糖更加困难，而且操作程序也很复杂，低聚半乳糖的含量本来就很少，最后提取出的低聚半乳糖的量无法满足人们的需求，所以直接从自然界中提取低聚半乳糖的方法不适合产业化、商业化。

3.2.2 化学合成法

通过大量的化学试剂提纯低聚半乳糖，在提取的过程中，化学试剂本身就会给生态造成污染，而且无法保证产物对人体的安全性，再加上整个过程的成本高，所以想要通过化学合成法制备低聚半乳糖并不现实。

3.2.3 生物催化法

酶法合成是目前已知应用较多且技术成熟的方法。酶具有高效性、专一性且反应条件温和等优点。在催化合成低聚半乳糖的反应中，β-半乳糖苷酶有着很重要的位置，在与乳糖反应的过程中表现出高活性的转苷特性，而且酶的来源大多对人类无害，不会造成环境的污染，也比较容易获得，是目前产业化生产低聚半乳糖的主要方法之一[22-23]。

21世纪以来，人们对功能性食品的重视度越来越高，其中也有着低聚半乳糖的身影。导致国内外对于低聚半乳糖的研究逐渐增多，更加工业化、产业化。较为经典的催化合成低聚半乳糖的方法有2种：1) 利用自然界本身存在的菌株中的β-半乳糖苷酶，包括粗酶和纯酶，与乳糖发生转苷反应得到低聚半乳糖[24-25],但想要从野生菌株中分离且纯化出β-半乳糖苷酶不仅成本高，而且步骤繁琐;2) 通过已知基因序列进行人工合成，获得重组工程菌[26-27],再利用该菌株制备低聚半乳糖。相较于野生型菌株，人为合成的工程菌在酶的纯化等方面更加方便，且同样安全。

4.1 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC 3.2.1.23)，也称乳糖酶，具有水解乳糖的作用，能够将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖[28]，在乳制品行业中，可用来降解其中的乳糖生成单糖，以此解决乳糖不耐症等问题；
β-半乳糖苷酶不仅有水解乳糖的特性，同时也具有转苷特性，将水解乳糖后的半乳糖为底物进行转糖苷反应，生成低聚半乳糖，增强其益生特性。

4.1.1 β-半乳糖苷酶的分布及不同来源在转苷反应中的酶学特性比较

β-半乳糖苷酶在自然界中普遍存在，大致上可分为3类:1) 动物源：存在于哺乳动物幼年时期的肠道当中；
2) 植物源：如大蒜、洋葱、草莓及拟南芥等中；
3) 微生物源，也是存在总量最多的一类；
细菌、霉菌和酵母被人们研究的较为广泛，同时也有很多研究成果。其中,已经参与到工业化生产低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶制剂来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyvernmoyces lactis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等[29]。

4.1.2 β-半乳糖苷酶在转糖苷反应中的酶学性质比较

β-半乳糖苷酶因来源广泛，导致其在转苷反应中的特性也不尽相同(表1)。韩明明等[30]从驼乳中获得了具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶，在温度65 ℃，pH值7.0，反应时间4.0 h，乳糖初始浓度为450 g/L的条件下，转苷率达到了31.51%；
李宗显等[31]通过克隆克雷伯氏菌B5582Y中的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中实现了异源表达，在温度44 ℃，pH值7.0～7.5，反应时间10.0 h，乳糖初始浓度浓度为900 g/L的条件下，转苷率高达44%；
前人研究显示，通过利用从嗜酸乳杆菌ATCC 4356获得的粗β-半乳糖苷酶进行低聚半乳糖的合成，在温度50 ℃，pH值6.8，反应时间15.0 h，乳糖初始浓度为400 g/L的条件下，转苷率为21.5%[32]；
Li等[33]发现源自南极的一种类单胞菌ANT 48，并将其中编码β-半乳糖苷酶的基因成功在大肠杆菌中进行了表达，且与乳糖进行了转苷反应，在温度40 ℃，pH值6.6～7.0，反应时间15.0 h，乳糖初始浓度为906 g/L的条件下，转苷率达到了30.9%；
Frenzel等[34]利用环状芽孢杆菌中的β-半乳糖苷游离酶与乳糖进行转苷反应，在温度40 ℃，pH值7.0，最终反应时间25 h，乳糖初始浓度为390 g/L的条件下，转苷率为41%；
Fischer等[35]利用乳酸克鲁维酵母中的β-半乳糖苷游离酶与乳糖进行转苷反应，在温度45 ℃，pH值6.5，最终反应时间8 h，乳糖初始浓度为200 g/L的条件下，其转苷率为32%；
以上6例均为野生型酶在适当的乳糖浓度下进行的转糖苷反应，接下来介绍关于米曲霉源的β-半乳糖苷酶野生型酶及其在分子改造后的改造酶的转糖苷率，并将俩者进行对比。许牡丹[36]等利用米曲霉中β-半乳糖苷酶与乳糖进行转苷反应，在温度55 ℃，pH值6.0，反应时间32 h，乳糖初始浓度为400 g/L的条件下，转苷率为32.4%；
Gao等[37]先对米曲霉中的酶进行分子改造，改造形式为氨基酸的定点突变，其中，双突变体N140C/W806F的最佳反应条件：温度40 ℃，pH值4.5，反应时间7 h，乳糖初始浓度600 g/L，最终的转苷率高达59.8%。

表1 不同来源酶的酶学特性及转苷率

4.2 分子改造的概述

虽然带有β-半乳糖苷酶的菌株有很多，但是每一种来源的酶的特性都不一样，相同单位的酶所能合成出的低聚半乳糖的量也不一样，此时需要通过酶工程相关的手段对β-半乳糖苷酶进行定向改造。

对某一特定酶的分子改造一般要经历3个阶段：1) 扮演“定点突变”的理性设计阶段；
2) 非理性设计阶段的代表“定向进化”；
3) 将生物信息学的相关技术与高通量筛选技术相结合，筛选出目的菌株。

简单来说，定点突变的特点是“所变即所得”，量少但精准；
定向进化的特点是“所筛即所得”，进化后的突变菌株在量大的同时也提高了突变为所需菌株的可能性。

4.2.1 糖苷酶的分子改造

众所周知，糖苷酶无论是在农业、畜牧业还是在生物制药、食品领域中都起着至关重要的作用[38]。然而这一类糖苷酶的酶学特性都是自然赋予的，其中的催化活性、热稳定性和pH值稳定性及对底物的选择性往往无法完美的满足于人们需求，需要在分子层面利用酶工程手段对其进行改造和优化[39]。改变酶的酶学特性，从而使该酶的某一特性得到提升，如反应体系的温度下降，底物浓度不变的情况下，水解产物的量得到提升等。

4.2.2 β-半乳糖苷酶的分子改造

目前已知，β-半乳糖苷酶在医药领域、食品添加剂的制备、婴幼儿食品中有很大的作用，是工业化的枢纽之一。国内外对β-半乳糖苷酶的改造手段有很多，集中归类可分为以下4点(表2)。

1) 减轻半乳糖的竞争性抑制。Hu等[40]对黑曲霉源的β-半乳糖苷酶中的一段氨基酸序列进行定向诱变，并从所得文库中得到了对半乳糖抑制敏感度降低的突变株。

2) 提高酶的热稳定性。前人研究表明，在克鲁维乳酸菌源的β-半乳糖苷酶中通过分子改造引入了二硫键，使得热稳定性得到了提高[41]。

3) 改变糖苷键的成键类型。Yin等[42]对芽孢杆菌源的β-半乳糖苷酶中的+1亚位点附近的残基R484进行突变，使所得的低聚半乳糖中的β(1-3)糖苷键的占比得到提升。

4) 提高酶的转苷能。Wu等[43]对硫化叶菌中β-半乳糖苷酶进行定点突变，得到突变体F359Q和F441Y，对比野生型酶，二者的转苷率都有提升，前者提升至58.3%，后者提升至61.7%。

前人研究显示，对黑曲霉源的β-半乳糖苷酶中的806位点进行突变，将色氨酸突变为苯丙氨酸，提高了酶的转苷能力[44]。

表2 不同来源酶的改造方向及改造结果

4.2.3 提高β-半乳糖苷酶转苷能力的定向进化方法

β-半乳糖苷酶属于GH的一种，虽然水解酶的分支有很多，但在水解底物时的转苷机制是大同小异的。例如β-半乳糖苷酶在催化乳糖的过程中，会同时进行水解反应和转苷反应，其中大多数都是以水解反应为主，转苷能力相对较弱，也就导致低聚半乳糖的产率很低。所以攻克这一难题也就成为了国内外的研究热点。根据该酶的催化机理，国内外在得到相关酶的晶体结构做了针对实验，可归类为以下3种：

1) 突变-位点氨基酸：原理是破坏了反应的中间态，造成转苷反应占据优势的效果。例如通过突变α-l-阿拉伯呋喃糖酶中的-位点氨基酸，最终使低聚木糖的转化率得到了提高[45-46]。

2) 改造+位点氨基酸：原理是提高酶的活性中心与底物的亲和力。例如将+位点氨基酸改造成芳香族氨基酸，使GH16家族酶的转苷能力提高[47]。

3) 增加酶活性中心的疏水性：原理是将活性中心附近的氨基酸突变为疏水氨基酸，打破水解和转苷反应原有的占比，提升转苷反应的占比。例如将木聚糖酶活性中心附近的酪氨酸突变为苯丙氨酸，导致该酶的水解活性急剧下降，变相提高了转苷占比[48-49]。

5.1 低聚半乳糖在食品领域中的应用

功能性低聚半乳糖在调节人体免疫功能、增殖肠道菌群、提高微量元素及矿物质吸收等方面具有优良特性。在乳制品、烘焙食品和部分饮品中都起到了不同程度的作用。

5.1.1 低聚半乳糖在乳制品中的应用

因为我国在功能性低聚糖方面研究的起步时间较日本及一些欧洲国家晚，所以低聚半乳糖在乳制品中的应用更多的集中于一些婴儿的配方乳粉及老年人食用乳粉中[50]。在食用未添加低聚半乳糖的乳粉时，经常会出现大便干燥甚至是便秘的症状；
研究表明，在添加低聚半乳糖后，可以有效的解决这一问题的发生率[51-52]。以人类目前的技术手段来说，现存的所有配方奶粉所能起到的作用都无法与天然母乳相比，添加低聚半乳糖的目的，就是为了更好的使人工配方奶粉的作用接近母乳，更加有益于消费者的健康。

5.1.2 低聚半乳糖在烘焙食品中的应用

21世纪以来，购买并食用高纤维、低热量、低糖食品不仅是一种选择更是一种时尚。根据低聚半乳糖低热值、良好的耐热性及保水性，不仅在烘焙过程中增加食品益生特性，而且也延长了货架期。

5.1.3 低聚半乳糖在饮料中的应用

得利于低聚半乳糖优良的耐酸性，使其可以在pH值较低的环境中保持稳定，故在生产饮料，尤其是酸性饮料和果汁中可以添加一定的剂量，即使是在高温消毒的生产环节中也能保证其结构不被破坏，且本身拥有的甜味也不会影响饮料本身的口感和风味。

5.2 低聚半乳糖在医药领域中的应用

近些年来，不论是在国内还是国外，肥胖症患者数量与日俱增[53]。肥胖症本身并不可怕，可怕的是与之相关的综合症甚至癌症的发生[54]。研究表明，人体摄入一定剂量的低聚半乳糖后，可以有效调节体重和食欲[55]。功能性低聚糖在促进肠道双歧杆菌等益生菌和增强肠道功能等方面起积极作用[56-57]。在减少体内脂肪摆脱肥胖症这一行动中，低聚半乳糖等益生元更多起到的是辅助功能，最终还是要以运动配合医嘱为主。

5.3 低聚半乳糖在畜产领域中的应用

低聚半乳糖不仅在人体中作用巨大，在动物的机体也同样起着积极作用。例如，在家养畜禽的饲养环节中，难免会发生肠道菌群失调、免疫功能下降及生长缓慢等问题。研究表明，用添加了低聚半乳糖的饲料进行喂养，可以有效调节这一系列问题，并且激活肠道本身的免疫功能[58]。根据低聚半乳糖等类似的功能性低聚糖的理化特性，其在畜产领域中的应用前景还相当广阔，有待于人们进一步的挖掘和研究。

综上所述，低聚半乳糖仍然是人们不可或缺的功能性低聚糖，不仅在功能性食品及保健食品的种类开发上前景广阔，还在畜产方面有很大的开拓空间。但在合成低聚半乳糖的研究当中，相关的酶制剂来源单一，纯度低且成本高，目前可以实现商业化产业化的β-半乳糖苷酶的来源还没有一个较好的选择；
所以选取酶的来源仍然是研究的重点，益生菌来源的β-半乳糖苷酶不乏是一种新的思路。再通过分子改造的相关技术，有选择性、针对性地对野生型酶进行进化、突变，使之在转苷反应中起到更优良的作用，更符合实验的需要，以加快国内突破酶法合成低聚半乳糖相关难题的进程，实现高效制备。在分子改造后还要对突变体进行基因组及生物信息学的分析[59-60],确定其家族。将类似的思路与想法应用到其他类似低聚半乳糖的功能性低聚糖的生产当中，让国内的益生元产业壮大，满足国人的日常需要，使大健康产业得到扶持，推动我国的经济发展、社会发展。

猜你喜欢低聚糖半乳糖糖苷酶澳新拟批准来自转基因米曲霉的多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶作为加工助剂食品与生物技术学报(2022年1期)2023-01-11茶条槭叶化学成分的分离鉴定及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究中草药(2022年20期)2022-11-154种哺乳动物乳中低聚糖的定性和定量分析研究进展食品科学(2022年13期)2022-07-29生物催化法制备低聚半乳糖的研究进展发酵科技通讯(2021年1期)2021-03-18β-葡萄糖苷酶的研究进展化工设计通讯(2021年2期)2021-01-07如何应对半乳糖血症家庭百事通·健康一点通(2020年12期)2020-12-31响应曲面法优化木聚糖酶解法制备玉米秸秆低聚糖工艺研究农产品加工(2020年20期)2020-11-14木蝴蝶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用中成药(2017年8期)2017-11-22日粮添加低聚糖对断奶仔猪生长性能的影响猪业科学(2017年6期)2017-07-18猴头菌丝固体培养物及胃乐宁片低聚糖部位的HPLC-ELSD指纹图谱中成药(2017年6期)2017-06-13