新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

彭晓燕 ， 陆盼盼 ， 胡祖权

贵州医科大学生物与工程学院，贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心，贵阳 550025

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）简称新型冠状病毒，能够引起严重的急性呼吸道疾病，具有极强的传染性。该病毒在世界范围内流行并不断出现新的变异毒株，给全球公共卫生安全带来严峻挑战和威胁，免疫学诊断和治疗是目前研究的重点领域［1-2］。

新型冠状病毒由囊膜和核衣壳组成，囊膜上主要有表面刺突蛋白（spike protein， S）、膜蛋白（membrane protein， M）和包膜蛋白（envelope protein， E）等3种结构蛋白质［3］，其中S蛋白与其传染能力及致病机制密切相关。在病毒进入宿主细胞的过程中，S蛋白会被宿主细胞的蛋白酶切割为S1亚基和S2亚基，分别负责受体识别和膜融合［4］。S1亚基又分为N末端结构域（N terminal domain， NTD）和C末端结构域（C-terminal domain， CTD），蛋白晶体结构显示新型冠状病毒的CTD为 受 体 结 合 域（receptor binding domain，RBD），主要负责识别细胞表面特异性受体——血管紧张素转化酶Ⅱ（angiotensin converting enzymeⅡ， ACE2），从而介导病毒与宿主细胞的相互作用［4-6］。因此，阻断RBD与ACE2的结合能够阻止新型冠状病毒进入细胞内，以RBD为靶标的特异性抗体或小分子抑制剂是抗新型冠状病毒药物研发的有效策略之一［3，7］。同时，免疫学诊断具有操作简单、特异性高、重复性好和高效低廉等优点，现已成为临床上最普遍的检测手段之一［8-10］，优化基于抗RBD抗体的免疫诊断方法对于新型冠状病毒的快速初筛和日常监测具有重要意义。

本研究通过基因克隆操作构建原核表达系统，在大肠杆菌中大量表达含有不同标签蛋白的RBD重组蛋白，并验证其可溶性和免疫原性，以期为通过抗体库技术分离抗RBD重组抗体及进一步发展新型冠状病毒的免疫诊疗方法奠定基础。

1.1 实验材料

大肠杆菌XL1-Blue、pGEX-6P-1和pET-32a（+）载体由华中农业大学分子生物技术实验室馈赠，含RBD基因的pET-32-RBD质粒由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院馈赠。6～8周龄Balb/c小鼠由贵州医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（黔）2018-0001）提供，室温20～25 ℃，光照黑暗周期为12 h，分笼标准饲养，自由采食饲料和水。

1.2 仪器与试剂

酶标仪购自BioTech公司；
冷冻高速离心机购自丹麦LaboGene公司；
超声波破碎仪购自宁波新芝生物科技有限公司；
恒温摇床购自苏州捷美电子有限公司；
垂直电泳仪和凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司；
转印仪、水平和垂直电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；
PCR仪购自美国ABI公司；
纯水仪购自英国ELGA公司；
Syngene成像系统购自基因有限公司；
Tryptone和Yeast extract购自英国OXOID公司；
脱脂奶粉购自武汉博士德生物工程有限公司；
对硝基苯磷酸二钠购自上海Sigma-Aldrich公司；
质粒DNA提取试剂盒购自Omega公司；
亲和层析柱和Ni-NTA基质购自德国Qiagen公司；
GST纯化基质购自上海碧云天生物技术有限公司；
工具酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司；
AP标记和HRP标记羊抗鼠抗体购自上海默克公司；
ECL发光液购自大连博格林生物科技有限公司；
引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 原核表达载体构建

培养含pET-32-RBD质粒的重组大肠杆菌，用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，通过PCR扩增目的基因，采用EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切RBD片段、pDEX-6P-1载体和pET-32a（+）载体，制备1%琼脂糖凝胶电泳检测。随后，利用T4 DNA连接酶连接目的基因和载体，构建重组载体pGEX-RBD和pET-RBD。电转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，涂布于LB固体培养基（含100 μg·mL-1氨苄）平板，37 ℃过夜培养12～16 h至长出单克隆菌落。挑取菌落培养，利用基因特异引物进行PCR鉴定，并送公司用载体特异引物测序验证。

1.4 RBD蛋白的原核表达及纯化

取测序正确的pGEX-RBD和pET-RBD重组质粒菌液分别接种于含100 μg·mL-1氨苄的LB液体培养基中，37 ℃，200 r·min-1振荡培养12～16 h。将培养菌液按1∶100接种于新鲜培养基中，37 ℃、200 r·min-1振荡培养至OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG，置16 ℃、200 r·min-1恒温摇床诱导培养20 h，离心收集菌体。PBS悬浮菌体，超声波破碎处理后收集上清液，利用GST纯化柱纯化GST-RBD融合蛋白，以及Ni-NTA基质纯化RBD-His融合蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白的表达情况。

1.5 多克隆抗体的制备

用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原，取3只6周龄Balb/c小鼠进行免疫，共进行4次免疫，每次免疫间隔时间为10 d，抗原剂量为每只小鼠25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第2次和第3次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第4次免疫用等量生理盐水混合。完成4次免疫后7 d取小鼠静脉血制备抗血清。

1.6 间接ELISA法测定抗血清滴度

用PBS稀释RBD-His融合蛋白至1 μg·mL-1，取100 μL加入96孔酶标板，并设置PBS空白对照，于37 ℃包被2 h，用200 μL PBS洗涤3次。加入150 μL封闭液，37 ℃水浴2 h，用200 μL PBS洗涤3次。将待测抗血清以100、200、400、800、1 600、3 200倍比梯度稀释，每孔加入100 μL，于37℃孵育1 h后，用200 μL PBST和PBS分别洗涤3次。加入100 μL按1∶5 000稀释的AP标记羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用200 μL PBST和PBS分别洗涤3次。加入100 μL 0.2% pNPP显色液，黑暗条件下反应30 min，用酶标仪测OD450读值。

1.7 Western blot分析

取20 μL RBD-His融合蛋白，经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜。将膜裁剪后用封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST溶液）封闭2 h，再分别用1∶2 000稀释的抗血清于37 ℃孵育1.5 h。用TBST洗涤3次，加入1∶5 000稀释的HRP标记羊抗鼠抗体，37 ℃孵育1 h。TBST和TBS分别洗涤5次后，加入ECL发光液，SynGene成像系统曝光显色。

2.1 原核表达载体构建

根据RBD基因序列设计特异引物，PCR扩增目的基因，凝胶电泳检测结果（图1）显示，获得的RBD基因片段大小约为700 bp，与预期大小相一致。利用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切目的基因以及载体pGEX-6P-1和pET-32a（+），通过酶连接获得pGEX-RBD和pET-RBD重组载体。

图1 PCR扩增RBD基因片段Fig. 1 PCR amplification of RBD gene fragment

2.2 阳性转化子鉴定

重组载体通过电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中，随机挑取10个单克隆菌落培养后进行PCR鉴定，结果显示均扩增出大小约为750 bp的基因片段（图2），与预期大小相符。然后，利用载体特异性引物测序，比对结果显示，目的基因与RBD基因（GenBank登录号：BC032538.1）的序列相同，表明重组表达载体构建成功。

图2 PCR鉴定阳性转化子Fig. 2 PCR identification of the positive transformants

2.3 重组蛋白原核表达及纯化

重组菌株XL1-Blue/pGEX-RBD和XL1-Blue/pET-RBD的菌液经IPTG诱导表达及超声波破碎处理后，取上清液分别用GST和His基质纯化GST-RBD和RBD-His融合蛋白。SDS-PAGE结果（图3）显示，GST-RBD融合蛋白大小约为53 kD，RBD-His融合蛋白大小约为33 kD，与预期结果相符合，表明原核表达获得了可溶性的GST-RBD和RBD-His融合蛋白。

图3 SDS-PAGE检测纯化的融合蛋白Fig. 3 SDS-PAGE detection of the purified fusion proteins

2.4 多克隆抗体效价分析

用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫3只Balb/c小鼠，用RBD-His融合蛋白作为检测抗原分析多克隆抗体的效价。ELISA检测结果（图4）显示，3只小鼠均产生了多克隆抗体，效价达到约1∶3 000，其中1号和3号小鼠产生了较高亲和力的多克隆抗体。

图4 ELISA检测多克隆抗体的效价Fig. 4 ELISA detection of the titers of polyclonal antibodies

2.4 多克隆抗体特异性分析

将RBD-His融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，再分别用不同免疫小鼠产生的多克隆抗体进行Western blot分析。结果（图5）显示，3只免疫小鼠产生的多克隆抗体均出现蛋白杂交条带，而对照组无条带出现，表明获得的多克隆抗体可特异性识别RBD蛋白。

图5 Western blot检测多克隆抗体特异性Fig. 5 Western blot detection of the specificities of polyclonal antibodies

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情给全球公共卫生安全和经济社会发展带来了严重威胁。目前，在广泛推行疫苗接种和核酸检测基础上，众多科学家正在竭力研发更有效的防治手段和诊疗方法。目前的检测方法主要包括核酸检测、抗原检测和抗体检测［8-9］，前2种方法主要是针对病毒本身的检测，在感染初期即可有效筛查，而抗体检测则是检测机体针对病毒免疫应答产生的IgM或IgG抗体。核酸检测灵敏度高、特异性好，但对实验室、设备和人员的要求较高，而且操作繁锁；
抗原检测操作简便、快捷，但灵敏度稍差，仅能作为核酸检测的补充；
抗体检测可评价抗体药物和疫苗的临床效果，但不适用于感染初期的检测，而且存在一定的误判率［8-10］。因此，核酸检测是确诊的标准方法，但发展免疫学检测方法仍具有良好的应用价值，其便捷高效性使其在大规模筛查时可作为快速初筛工具或家庭日常自测方法。

基于免疫学的新冠预防和治疗是众多科研团队的另一个研究重点［11-13］。目前在全世界普及的新冠疫苗主要包括病毒灭活疫苗、腺病毒载体疫苗和重组蛋白疫苗，接种疫苗对于病毒的防治效果起到非常重要的作用［13-14］。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》将2种特异性抗新型冠状病毒药物增加到诊疗方案中，包括美国辉瑞公司生产的PF-07321332/利托那韦片（paxlovid）以及我国首个自主研发的单克隆抗体药物（安巴韦单抗/罗米司韦单抗注射液）。安巴韦单抗的靶标是S蛋白的RBD结构域，能够促进S1亚基快速从新型冠状病毒上脱落，阻止病毒进入细胞内［15-17］。因此，RBD被认为是抗体中和治疗和疫苗开发的理想靶标。

本研究以新型冠状病毒S蛋白的RBD结构域为实验对象，分别构建了含有GST和His标签的重组蛋白表达载体，原核表达获得大量可溶性的GST-RBD和RBD-His融合蛋白，并通过动物免疫和抗血清滴度检测证实重组蛋白能够诱导机体的免疫反应。众所周知，原核表达系统是最常用的蛋白表达体系，具有生产周期短、操作简单、成本低廉等特点。但是，在原核生物中表达真核基因时，由于缺乏糖基化、乙酰化等蛋白翻译后修饰功能，使表达的蛋白不能正确折叠而形成包涵体，通过变性和复性获得大量可溶性的具有生物活性功能的蛋白质仍是当前研究的技术难点［18］。现有研究表明基因自身的特性是决定蛋白表达情况的决定性因素，但通过优化IPTG浓度、诱导表达的温度和时间以及与标签蛋白融合表达等策略可以显著改善蛋白质的表达水平和活性［19-22］。本实验通过优化表达条件，成功在大肠杆菌中获得了大量的GST-RBD和RBD-His融合蛋白。由于GSTRBD融合蛋白的分子量较大，以该蛋白作为免疫原能够刺激机体产生更强烈的免疫反应，以RBDHis蛋白作为检测抗原可以鉴别是否产生了针对RBD的多克隆抗体，可以有效地避免GST标签蛋白的干扰。总之，本研究通过原核表达体系获得了RBD融合蛋白，并验证其具有良好的免疫原性，为后续制备抗RBD的基因工程抗体以及研发以RBD为靶标的新冠诊疗方法提供了数据支撑。

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