莱茵衣藻蓝光受体植物类型隐花色素CRY,突变体的表型鉴定

李旺宁 张豪杰 李亚男 梁梦静 季春丽 张春辉 李润植崔玉琳 秦松 崔红利

（1. 山西农业大学农学院 分子农业与生物能源研究所，太谷 030801；
2. 中国科学院烟台海岸带研究所 海岸带生物学与生物资源保护重点实验室，烟台 264003）

光不仅能提供光合作用的驱动力，其自身蕴含的光信息对植物生长、发育、代谢及适应环境均具有重要作用［1］，而且还作为光信号参与调控植物生长发育的各个方面，如种子萌发［2］、器官生长方向［3-4］、叶片和繁殖器官在空间上的排列方式［5］、叶绿体运动［6］及开花时间等［7］。因此，植物进化出一套针对不同波段太阳光并由光受体介导的光感知与信号转导系统。

光受体是介导植物对光信号作出反应的一类生物大分子物质，可以感知光强、波长以及方向等，从而调控植物作出相应的生理反应，最终引起植物个体表型上的变化［8］。根据感受不同的光质，目前发现的光受体类型包括红光/远红光受体——光敏色素（phytochrome, PHY）、蓝光受体——隐花色素（cryptochrome, CRY）、向光素（phototropin, PHOT）和紫外光受体-UV（UV-B）。植物依靠蓝光受体隐花色素（CRY）和向光素（PHOT）感知蓝光信号，并通过复杂的接收和转导系统，进而与体内其他信号转导途径耦联，最终调控蓝光响应生理过程，蓝光在高等和低等植物生长发育过程中十分重要，能够调控光形态发生、叶绿体运动、下胚轴生长、开花时间、生物钟、生物节律、趋光性及次级代谢产物的合成等［9］。

隐花色素（CRY）是一类光裂合酶的黄素蛋白，其作用是调控蓝光下一些基因的表达及调控植物的光形态建成［10-12］。CRY 蛋白包括N 端光裂合酶同源结构域（photolyase homologous region, PHR）和C 端延伸的羧基端延伸结构域（CRYC-terminal extension, CCE）［13］。PHR 结构域由光裂解酶进化而来氨基酸序列比较保守，负责黄素腺嘌呤核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）和甲基四氢叶酸（N5-methyltetrahydrofolicacid, MTHF）的结合，CCE结构域氨基酸序列多变有很大差异，但具有相同的DAS（DQXVP-Acidic-STAESSS）基序［11］，被认为是光信号传递的主要结构域［14］。研究发现拟南芥中有2 个植物类型CRYs（CRY1 和CRY2）、1 个动物类型CRY［15］和1 个DASH（Drosophila、Arabidopsis、Synechocystis和Homo） 类 型CRY［16］。3 种 类 型CRYs 的细胞定位、表达模式、功能及作用机制都不完全相同［17］。

CRY 在真核微藻中分布广泛，并存在多个基因拷贝。真核微藻来源的CRY 主要包括动物类型（aCRY）、DASH 类型（dashCRY）和植物类型（pCRY）3 大类。在硅藻（Diatom）［18］和褐藻（Brown algae）［19］中发现了aCRY。海洋来源绿藻（Ostreococcus tauri）中分别发现了aCRY（OtCPF1）［20］和dashCRY（OtCPF2）［21］，并在另一株海洋绿藻（Ostreococcus lucimarinus）中发现了5 个编码CPF 的基因，但这两株绿藻中都没有发现pCRY［21］。据报道，红藻（Cyanidioschyzon merolae）［22］和等鞭藻（Isochrysis galbana）［23］中存在pCRY，在团藻（Volvox carteri）和莱茵衣藻中分别发现了4 个CRYs，1 个植物类型pCRY、1 个动物类型aCRY 和2 个DASH 类型［24-25］。团藻pCRY 在体细胞中大量表达，而在生殖细胞中很少表达［24］。莱茵衣藻中aCRY 不但可以感受蓝光信号，同时可以感受部分红光信号，通过构建莱茵衣藻aCRY 的突变株，发现细胞周期循环、节律调节、叶绿素及类胡萝卜素合成相关基因在转录水平上受到其调控［26］。pCRY 在黑暗下积累，在蓝光和红光条件下通过光依赖性蛋白酶迅速降解，其对蓝光响应的光谱特征已经在体外进行验证［24-25,27］。

关于向光素以及aCRY 的突变以及突变之后的表型变化已有文献报道，但pCRY 还未见报道。结合前人研究，海洋绿藻和淡水绿藻在2 种不同环境下的诸多生理差异以及不同藻株之间可能存在差异，对不同来源莱茵衣藻及CRY 突变株的表型也有待进一步的研究。

本研究以衣藻野生株CC5325 和突变株crcry为研究对象，对野生株CC5325 和突变株crcry藻株进行比较分析，从生长、色素、光合及油脂合成等方面比较其在正常光照CK（Control）与蓝光BL（Blue light）培养条件下的表型差异，以期评估cry在莱茵衣藻蓝光响应过程中所发挥的功能，为进一步生物学功能及调控机制的研究提供理论基础。

1.1 材料

1.1.1 藻种 试验所用的莱茵衣藻野生株CC5325和突变株crcry（Cre.06.g295200）均购自衣藻资源中心［28］，现保存于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。

1.1.2 培养条件 藻株培养条件设置为温度（24±1）℃， 光12 h/ 暗12 h、20 μmol/（m2·s），采用TAP（Tris-Acetate-Phosphate medium）培养基，crcry添加浓度为10 μg/mL 的巴龙霉素培养，每天定时手动摇瓶3-4 次，防止细胞贴壁，培养至藻细胞达到对数期。摇匀，取CC5325 和crcry各3 mL 至250 mL 锥形瓶中（含100 mL TAP 液体培养基），将装有CC5325 和crcry的锥形瓶放置黑暗中适应24 h，之后置于CK 条件和BL 条件下，每隔2 d 定时取样用于各项生理指标的测定。

1.1.3 光质 试验中分别设置正常（白光）和蓝光培养条件，以白光作为对照，连续24 h 光照。采用欧普照明LED 白光和蓝光2 种光质的灯具（40 W方形30 cm×30 cm，光照强度为1 100 lx，蓝光波普范围550 nm），光源安装在培养架两侧，每块LED灯板包括160 个LED 灯。通过移动锥形瓶与LED 灯的距离来调节强度，光强使用TES 1332A 勒克斯计测量，在试验前连续照射24 h 使系统稳定。每组设置3 个重复。

1.2 方法

1.2.1crcry突变体的分子鉴定 收集培养对数期的藻液离心备用，以CC5325 和crcry基因组DNA 和cDNA 为模板进行PCR。采用CTAB 法提取CC5325和crcry的基因组DNA，根据ChlaMmeSeq 方法［29］，扩增3 个片段用于测序，以确定crcry的确切插入位点。（1）用基因cry引物F+R 预测插入位点；
（2）F+C1（插入盒下游引物）与引物对的5′插入盒基因组连接；
（3）（插入盒上游引物）C2+R 与引物对的3′插入盒基因组连接。采用Trizol（杭州新景生物试剂开发有限公司）试剂提取CC5325 和crcry总RNA，参照TaKaRa 公司的试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）将RNA 反 转 录 成cDNA，用引物Actin-F+Actin-R 和cry-F+cry-R 验证。所有用于PCR 鉴定的引物见表1。反应体系如表2所示，反应程序为98℃ 5 min；
98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环，每个样品重复3 次。

表1 引物信息Table 1 Primers information

表2 PCR 反应体系Table 2 PCR reaction system

1.2.2 细胞密度的测定 每天定时吸取10 μL 摇匀的藻液，置于视野为40×10 倍的光学显微镜下观察，采用血球计数板（25×16 型）对莱茵衣藻细胞进行计数。

细 胞 密 度（cells·mL-1）=80 小 格 内 细 胞 个数/（80×400×10 000×稀释倍数）

1.2.3 单位细胞色素含量的测定 取5 mL 藻液4 500 r/min 离心10 min，弃上清液后向沉淀中加入与藻液等体积的95%乙醇充分混匀，75℃水浴15 min，冷却后4 500 r/min 离心10 min，用分光光度计测上清液在665、649 和470 nm 的OD 值，根据公式［30］计算藻细胞中叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的浓度Chla、Chlb 和Car（mg/L）含量。

Chla=13.95×OD665-6.88×OD649

Chlb=24.96×OD649-7.32×OD665

Car=（1 000×OD470-2.05×Chla-114.8×Chlb）/245

单位细胞色素含量（ng/cell）＝［色素含量（mg/L）/细胞密度（cells·mL-1）］×107

1.2.4 光合作用活性的测定 使用MINI-PAM-II 叶绿素荧光仪（H. Walz. Effeltrich, Germany）测定藻细胞的光化学活性（光化光设置为72 μmol/（m2·s））。藻液避光暗处理20 min，再检测光合生理指标的变化。实际光能转化效率（effective photo-chemical quantum yield of PSII, Y（II））、最大光能转换效率（maximum photochemical quantum yield of PSII, Fv/Fm）、光化学淬灭系数（coefficient of photochemical fluorescence quenching, qP） 和非光化学淬灭系数（non-photochemical quenching, NPQ）。

光 处 理5 min 后测定Y（II）和PAR 值，根据公式ETR=Y（II）×PAR×0.5×0.84 计算相对电子传递速率（electron transport rate, ETR）值。

1.2.5 总脂含量的测定 总脂含量的测定参照邵雪梅［31］方法，称取冷冻干燥后的藻粉50 mg，每个处理设置3 个生物学重复。藻粉中加入2.5 mL 氯仿、5 mL 甲醇，在37℃摇床中抽提24 h 后离心收集上层有机相，剩余藻粉残渣重复抽提2 次。合并3 次所得的上层有机相，加入5 mL 氯仿和9 mL 氯化钠溶液（10 g/L），离心后收集下层有机相到玻璃管中，用氮吹仪吹干样品至恒重。

总脂含量（%）=（总脂重量/藻粉重量）×100%

1.2.6 数据处理 对照组和处理组均设置3 个平行，采用excel（2019）和SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析法进行显著性分析（P<0.05），绘图采用Origin9 软件（OriginLab Corporation, USA）。

2.1 莱茵衣藻crcry突变体的鉴定

根据衣藻库（Clip）（https://www.chlamylibrary）对突变株crcry的描述，cry在其CDS 编码区有一个盒反向插入（图1-a）。为了验证该插入，分别在DNA 水平和RNA 水平进行验证。DNA 水平上用3对引物（cry-F+cry-R、cry-F+Cassette-C1 和Cassette-C2+cry-R，引物见表1）进行PCR。F（正向）和R（反向）分别位于假定插入位点的上游和下游，C1（反向）和C2（正向）分别位于盒的3′和5′端（图1-a）。以CC5325 基因组DNA 为模板，只有F+R 产生PCR产物（300-400 bp）。相反，以cry基因组DNA 为模板，F+R 没有产生PCR 产物，而F+C1 和C2+R 各有一条PCR 产物（F+C1：300-400 bp，C2+R：700-1 000 bp）（图1-b）。RNA 水平上用引物（Actin-F 与Actin-R 和cry-F 与cry-R，引物见表1）进行PCR，分别以CC5325 和crcry的cDNA 为模板，Actin-F 和Actin-R 各有一条PCR 产物（300-400 bp），cry-F 和cry-R 之间野生株CC5325 有一个PCR 产物（300-400 bp），相反，突变株crcry没有产生PCR 产物（图1-c）。表明盒成功插入并且表达。对这两个PCR 产物进行测序，结果证实该盒以反义方向插入crcry的CDS编码区中，保持其完整的5′和3′端（图1-a）。

对野生株CC5325 和突变株crcry进行固体平板以及液体筛选验证。莱茵衣藻CC5325 不具有巴龙霉素抗性，在含10 μg/mL 巴龙霉素的TAP 筛选平板上不能生长；
突变株crcry有巴龙霉素抗性基因，能够在含巴龙霉素的筛选平板上正常生长。将CC5325和crcry涂布于含有巴龙霉素的TAP 固体平板上（图1-d），弱光培养一周左右，可以看出CC5325 在含有巴龙霉素的平板上变白，而crcry生长出绿色单藻落。之后在含有巴龙霉素的TAP 液体培养体系中再次进行验证（图1-e），与图1-d 结果相同，CC5325 藻株在含有巴龙霉素的培养基中不能生长，但crcry能够正常生长。以上结果证明crcry突变株中AphVIII抗性基因成功表达，随后在TAP 液体培养基中进行扩大培养，用于后续试验。

图1 莱茵衣藻crcry 突变体的鉴定Fig.1 Identification of C. Reinhardtii crcry mutant

2.2 蓝光对莱茵衣藻野生株CC5325和突变株crcry生长的影响

用细胞密度来表示莱茵衣藻的生长情况。从图2 可以看出，正常光与蓝光条件下CC5325 存在差异，且在蓝光条件下生长较快。2 种光照条件下，crcry生长存在很大差异，蓝光下crcry生长明显受到抑制。随着培养时间的增加，细胞密度均在第6 天达到最大，CK-CC5325、CK-crcry、BL-CC5325 和BL-crcry的细胞数分别为2.124×107、2.249×107、2.423×107和1.563×107cells·mL-1，蓝光下CC5325 细胞数目是正常光下的1.14 倍，crcry是0.69 倍（图2）。培养到第8 天，正常光照条件下，CC5325 与crcry颜色差异不显著，较前期相比，藻液颜色变黄；
蓝光条件下，CC5325 与crcry颜色差异较显著，CC5325长势比crcry好。在正常光与蓝光条件下，CC5325差异不显著，crcry差异显著，蓝光条件下crcry颜色较黄。结果表明，正常光对衣藻CC5325 和crcry影响不大，然而蓝光条件对衣藻CC5325 和crcry影响较明显。

图2 蓝光对莱茵衣藻CC5325 和crcry 生长的影响Fig. 2 Effects of blue light on the growth of C. reinhardtii CC5325 and crcry

2.3 蓝光对莱茵衣藻野生株CC5325和突变株crcry单位细胞色素的影响

由图3 可知，蓝光辐射对莱茵衣藻单位细胞内色素的积累影响较大，且影响效果与处理时间有关。无论在正常光还是蓝光条件下，CC5325 与crcry的单位细胞色素含量前期均呈上升趋势，后期趋于平缓乃至降低。培养至第4 天，CC5325 与crcry在正常光下颜色差异不明显，但在蓝光下差异非常显著。CC5325 与crcry的单位细胞叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量均无明显差异。蓝光下crcry显著低于CC5325，其单位细胞叶绿素a 的含量为3.92×10-4ng/cell（图3-a）、叶绿素b 为2.26×10-4ng/cell（图3-b）、总 叶 绿 素 为6.12×10-4ng/cell（图3-c），与CC5325 相比，crcry的叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素分别下降了48.97%、64.53%和67.44%。在正常光下单位细胞中类胡萝卜素差异不显著，但在蓝光下，crcry中类胡萝卜素显著高于CC5325，含量为1.97×10-4ng/cell（图3-d），与CC5325 相比，增高了65.27%。单位细胞总色素在正常光下也没有差异，在蓝光下差异显著，CC5325 与crcry细胞中总色素含量分别为11.44×10-4和7.95×10-4ng/cell（图3-e），与CC5325 相比，crcry降低30.65%。单位细胞总色素的含量取决于总叶绿素和类胡萝卜素，尽管crcry类胡萝卜素含量高，但由于叶绿素含量所占的比例较大，所以crcry总色素仍然低于CC5325。正常光下类胡萝卜素与总叶绿素的比值随着培养时间的延长变化不显著，与正常光相比，蓝光下的野生株CC5325 显著降低，然而突变株crcry相反，显著高于正常光及蓝光下的CC5325（图3-f）。色素含量均在第6 天得到积累达到峰值，随后降低。

图3 蓝光对莱茵衣藻CC5325 和crcry 单位细胞色素的影响Fig. 3 Effects of blue light on the single cell pigments of C. reinhardtii CC5325 and crcry

以上结果表明，正常光条件对CC5325 和crcry的色素含量影响不明显，蓝光条件对CC5325 和crcry色素含量影响较大。且蓝光条件能够促进CC5325 色素的积累，不利于突变株crcry色素的积累，尤其是叶绿素。

2.4 蓝光对莱茵衣藻野生株CC5325和突变株crcry光合作用的影响

实际光化学效率Y（II）表示用于光化学反应的能量。从图4-a 中可以看出，Y（II）随着培养时间的增加呈先上升再下降的趋势，在第4 天达到最大，第6-8 天逐渐趋于稳定。正常光和蓝光条件下，CC5325 与crcry之间差异不明显，但蓝光条件下，Y（II）低于正常光条件。说明蓝光能够影响PSII 的光合性能。

最大光化学效率（Fv/Fm）用来表示植物潜在的最大光合活性（图4-b）。莱茵衣藻的Fv/Fm 受环境中光质的影响，在不同光质下，莱茵衣藻Fv/Fm 随培养时间增加均呈下降趋势，其中，蓝光的影响最大，尤其是对突变株crcry。Fv/Fm<0.6 表明藻细胞受到抑制，正常光条件下，培养至第3 天后，开始抑制藻细胞生长；
而在蓝光条件下，培养1 d 已开始抑制细胞生长，并且藻细胞受到的抑制随培养时间延长而加强，蓝光影响更显著。

相对电子传递速率（rETR）可以用来反映植物对光强的耐受能力（图4-c）。莱茵衣藻的相对电子传递速率（rETR）随着培养时间的增加先升高后下降，培养到第4 天，相对电子传递速率（rETR）达到最大，随后呈下降趋势。且蓝光下rETR 低于正常光条件，CC5325 与crcry相比较，在受到强光辐射后rETR 降低更快。crcry中细胞的光保护受损使ETR 降低，表明CRY 是这种藻类光保护的中心角色。

非光化学淬灭系数（NPQ）表示将过剩的光能以热的形式耗散掉的能力（图4-d）。在此过程中NPQ 都相应的增加，并且在第4 天达到最大值，表明在此条件下已发生热耗散，但随着处理时间的增加，NPQ 恢复到正常状态。NPQ 在CC5325 与crcry之间存在差异，蓝光条件下明显低于正常光条件。这表明在短期内蓝光可使莱茵衣藻产生胁迫诱导，但随着时间的延长，衣藻能够适应不同光质的环境。

光化学淬灭系数（qP）反映了PSII 反应中心的开放程度（图4-e）。白光及蓝光条件下，qP 先上升后下降，同样在第4 天达到最大，之后4-8 d 趋于稳定。CC5325 与crcry之间的qP 存在差异，蓝光条件下略低于正常光条件。

图4 蓝光对莱茵衣藻CC5325 和crcry 光合作用的影响Fig. 4 Effects of blue light on the photosynthesis of C. Reinhardtii CC5325 and crcry

2.5 蓝光对莱茵衣藻野生株CC5325和突变株crcry总脂的影响

培养结束时（第8 天），检测在正常光和蓝光条件下衣藻CC5325 和crcry的总脂含量（图5）发现，正常光条件下，CC5325 与crcry的总脂差异不显著，含量分别是38.16%和38.74%；
蓝光条件下，CC5325 与crcry总脂差异明显，含量分别是42.15%和15.96%。相比于正常光，蓝光能促进CC5325 总脂积累，增加了12.34%；
而抑制crcry总脂积累，下降了58.80%。表明蓝光有利于莱茵衣藻中总脂的积累，但不利于隐花色素破坏型的突变株中总脂的积累。

图5 蓝光对莱茵衣藻CC5325 和crcry 总脂的影响Fig. 5 Effects of blue light on the total lipid of C. Reinhardtii CC5325 and crcry

植物通过光受体介导的信号转导途径响应光信号。蓝光受体隐花色素能感知蓝光信号，在植物的蓝光响应中发挥重要的作用。隐花色素基因在拟南芥中被克隆以后，在番茄、蕨类以及苔藓乃至人体中都进行了相关研究［32-34］。研究表明，拟南芥中CRY1 和CRY2 对光形态建成起着重要的调控作用，其中，CRY1 在蓝光下主要抑制下胚轴的伸长，CRY2 主要控制光周期调控开花。

蓝光对微藻的生长具有显著的影响。Das 等［35］研究发现蓝光下微拟球藻（Vannochloropsissp）的比生长率有所提高，Gonçalves 等［36］发现蓝光有利于Tetradesmussp. 的生长。本研究发现，与正常光培养条件相比，CC5325 在蓝光下的生长较快，而突变株crcry的生长受到明显抑制，暗示cry在该藻株的生长过程中发挥重要作用。

蓝光对微藻新陈代谢的影响较大，有研究表明红光会引起细胞损伤，而蓝光能够明显提高藻类光合色素的含量［37］。本研究结果表明，蓝光下CC5325 叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及总色素含量高于正常光，这与沈银武等［38］研究结果一致，蓝光对中华植生藻中叶绿素b 和类胡萝卜素合成有促进作用。crcry在蓝光下的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及总色素含量均低于CC5325。同时发现正常光下，CC5325 与crcry类胡萝卜素的含量差异不明显；
在蓝光下两者之间类胡萝卜素差异非常显著，crcry显著高于CC5325，而Im 等［39］研究发现，暴露于连续低强度蓝光可提高LHCBM6、GSAT 和PDS 转录水平，但在突变株（Ri20, PHOT 水平<10%的野生类型藻株）中的转录水平较野生株（CC-124）相比积累较少，造成这一现象的原因可能是蓝光强度差异以及突变株的不同。本研究发现正常光条件下，CC5325 及crcry的类胡萝卜素比叶绿素的比值相对稳定；
蓝光条件下，CC5325 类胡萝卜素比叶绿素的比值略微降低，crcry恰恰相反，显著升高。暗示藻细胞在不同光质条件下，类胡萝卜素比叶绿素的比值变化，是响应光质很重要的一个指标，进一步证明莱茵衣藻在蓝光的响应过程中，cry介导调控了叶绿素与类胡萝卜素的合成，来导致比率的变化，进而响应蓝光光质。

光质可以对植物的生长、品质及产量产生影响，这与光质可调控植物的光合作用密切相关［40］。结合叶绿素荧光曲线图和具体参数，发现蓝光辐射引起了PSII 反应中心的变化。本研究通过叶绿素荧光参数来反映不同光质（正常光、蓝光）下莱茵衣藻的光合性能发现，蓝光下藻细胞Y（II）、Fv/Fm、rETR、NPQ 和qP 值均低于正常光，且蓝光下crcry低于CC5325。Y（II）实际光化学效率前期呈上升趋势，第4 天达到最大，之后下降至稳定；
Fv/Fm 均呈下降趋势，该结果与前人对斜生栅藻（Scenedesmus obliqnusFACHB-1986）和铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的研究结果相类似［41］；
rETR 也是先上升后下降，蓝光下低于正常光，推测可能在这种条件下，更多的光能可能用于类胡萝卜素的合成；
NPQ 均低于正常光,这与高光下结果相一致，表明过量的光能超过藻细胞自身的承受能力,不能以热的形式耗散掉；
qP 的变化趋势NPQ 几乎是一致的，均先上升后下降。

蓝光是促进微藻细胞积累关键产物的有效刺激因子，同时对油脂的积累也有非常重要的影响。周玉娇等［42］研究表明，小球藻突变株油脂含量与野生型相比有所提高。本研究亦发现正常光下突变株crcry总脂稍高于野生株CC5325；
相反，蓝光下crcry总脂含量远低于CC5325。同时，与正常光相比，蓝光促进了CC5325 藻细胞中油脂的积累，这与小球藻［43］、微拟球藻［44］和雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）［45］等微藻积累油脂结果一致；
蓝光抑制了crcry中油脂的积累，Beel 等［26］发现蓝光条件下aCRY 突变体中的大多数与代谢相关的基因，以及编码细胞周期成分的基因都受到aCRY 调节。本研究推测，蓝光条件下crcry含量较低可能与油脂代谢相关基因受pCRY 调节相关，由于基因片段插入cry，导致该基因在转录水平上中断，从而不能响应蓝光辐射，因此蓝光下crcry中油脂含量比较低。

crcry表现出生长差、颜色黄、类胡萝卜素含量增高、叶绿素、光合指标及总脂降低。cry参与了莱茵衣藻蓝光响应的过程。

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