裸花紫珠调控IGF-1/PI3K/Akt信号通路对糖尿病足溃疡大鼠创面愈合的影响

李吉庆 林道斌 张永杰 陈学武

(广州中医药大学附属海南省中医院内分泌科，海南 海口 570200)

糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病的并发症之一，及时对DFU干扰医治，可以有效降低肢体坏死和脓毒血症的发生风险〔1〕。然而，DFU治疗缺乏特效药物，在DFU发生早期促进创面愈合仍是临床上亟待解决的难题〔2〕。裸花紫珠在海南黎族区域较多，是海南传统民族药材，性味苦、微辛、平，具备散瘀、止血、解毒、消肿等功效。据研究，裸花紫珠的主要化学成分包括黄酮类化合物、挥发油、酚萜类等〔3〕，此外有研究显示，裸花紫珠对创伤性伤口具有抗炎、止血和加速伤口愈合的作用〔4，5〕。有研究证明，胰岛素样生长因子(IGF)-1/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路影响DFU创面愈合具有重要的作用，本研究探讨裸花紫珠调控IGF-1/PI3K/Akt信号通路对DFU大鼠创面愈合的影响。

1.1主要实验仪器 超纯水仪(上海讯辉环保科技有限公司公司)；
激光共聚焦成像体系、切片机、展片机、烤片机(德国徕卡公司)；
倒置光学显微镜(中国明美公司)；
血糖仪及血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司)；
Millpore-Q超纯水器广州东锐科技有限公司；
实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增仪(广东精普实业有限公司)。

1.2主要实验材料 裸花紫珠药材购自海南省中医院中药房，柠檬酸钠缓冲液、链脲佐菌素(STZ)均购自上海如吉生物科技有限公司，RNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，PCR引物由云南一同实验教育科技有限公司合成。引物序列(5′-3′)为：IGF-1上游：GTCGATTCGTAGCGGTTCGGA，下游：TCGATAGTCAAGGAAGTTA；
IGF-1R上游：GGATTATCGGTAGGCCCAA，下游：TTGGCTTAGGTTCGAACC；
PI3K上游：CGATGGCCTTAACGAGGTTAA，下游：TGGTTACAAGGTTCAC；
Akt上游：ACGGCATGTTGGGCGTACCAGCT，下游：TTGGTTAATCCTCAAGG；
eNOS上游：GAGACAGCCGGGCTTA，下游：TGATCGTAGTGATGATGATAA；
VEGFR2上游：TCACGTGGTACTTAGGACC，下游：CAAGCTTACGA-TTCCGC。

1.3实验动物 SPF级健康SD大鼠48只，雌雄各半，体重(200±22)g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0011。

1.4方法

1.4.1裸花紫珠水提物制备 裸花紫珠干燥、粉碎、过40目筛，加水浸泡2 h后加热回流提取3次，加水量为药物质量10倍。在1 h后萃取1 h，在蒸发盘中取出过滤，并在水浴上蒸发后，在105℃下干燥24 h，干燥后快速冷却半小时，得到提物。使用前用适量纯净水将药物调匀。

1.4.2大鼠DFU模型制备及药物干预方法 大鼠自适应喂养1 w，将12只大鼠随机选择正常组，剩余的大鼠用作模型组。正常组给予普通饲料喂养，模型组给予高糖高脂饲料(配料比例是鸡蛋∶奶粉∶蔗糖∶猪油∶普通饲料为2∶5∶20∶15∶58)喂养4 w。

4 w后，禁食不禁水12 h，正常组一次性腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液，模型组腹腔注1%STZ(45 mg/kg，由pH4.5的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液配制)创建糖尿病大鼠模型。注后3 d测空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功〔2〕，若失败则再次腹腔注射1%STZ溶液(10 mg/kg)，维持高血糖状态4 w。此外，为避免大鼠死亡，若大鼠血糖高于25 mmol/L则给予胰岛素降糖。

造模成功后取36只模型大鼠及正常组12只大鼠给予3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常规消毒，使用直径为2.5 cm的打孔机器，使伤口在大鼠背面，深度到筋膜层〔2〕。创面造模成功后，所有大鼠常规消毒止血。分为正常组、模型组、凡士林纱布组、裸花紫珠治疗组各12只。正常组及模型组给予生理盐水纱布外敷治疗，其余两组则用相应敷料纱布覆盖创面治疗。各组均在相应敷料上层再覆盖无菌纱布并在最外层给予绷带包扎，每日换药1次。药物干预期间密切观察大鼠情况，如有撕咬敷料或纱布，及时处理。治疗期间大鼠均单笼给予基础饲料喂养，室温维持在22～25℃，湿度55%～65%，保持12 h光照，昼夜循环。

1.4.3大鼠创面愈合情况及创面病理学观察 分别于给药后3、7 d观察创面愈合情况，包括创面颜色、组织肿胀程度及渗出液等。操纵相机摄影，用Photoshop处理相片，测算创面面积，根据公式：创面愈合率=(创面初始面积-给药后第n天创面面积)/创面初始面积×100%，计算创面愈合率。在上述观察完成后，每组各随机抽取6只大鼠，给予戊巴比妥钠麻醉，采集创面及周围2 mm的组织，一部分经过4%多聚甲醛固定组织24 h后，进行苏木素-伊红染色，观察创面及创周组织学变化，包括毛细血管、炎症细胞、纤维细胞等。另一部分生理盐水冲洗后，吸干水分后置于-80℃冰箱，待RT-PCR检测。

1.4.4大鼠创面组织中IGF-1、IGF-1受体(IGF-1R)、PI3K、Akt、一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)2 mRNA表达水平检测 应用RT-PCR检测组织中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平。首先按照试剂(盒)说明书步骤提取组织总RNA并测定其含量，以cDNA为模板扩增。反应条件：95℃预备变性 10 min；
95℃变性 10 s，56℃退火 30 s，72℃蔓延30 s，40个循环，2-ΔΔct法计算mRNA相对表达量。

1.4.5Western印迹检测组织中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表达 干预后取各组创面组织提取蛋白定量后保存。10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、封闭，随后分别用IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2的一抗室温孵育2～3 h，用相应的二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，最后超敏发光液显色、曝光。

1.5统计学方法 采取SPSS25.0软件单因素方差分析、独立样本t检验。

2.1一般情况比较 开始喂食高脂高糖饲料至注射STZ溶液前，两组毛色光滑明亮，饮食、活动均正常，第1周至第4周模型组体重较正常组明显增长(P<0.05)，注射STZ溶液后，第5周两组体重无明显差异(P>0.05)，第6～8周模型组体重较正常组明显下降(P<0.05)。见表1。注射STZ溶液后，模型组毛色逐渐枯黄、杂乱，皮下脂肪减少，并出现多饮、多食、多尿等现象，模型组与对照组注射后第3天血糖为〔(22.63±1.46)、(5.76±1.14)mmol/L〕，注射STZ前为〔(5.93±1.12)、(6.01±0.96)mmol/L〕，模型组注射STZ前后血糖存在显著差异(P<0.05)，而正常组一般情况无明显变化(P>0.05)。

2.2各组创面愈合率 治疗后第3天和第7天，模型组的创面愈合率均明显低于正常组，其中第3天凡士林纱布组、裸花紫珠组显著高于模型组(P<0.05)。第7天凡士林纱布组较模型组愈合率明显增高，而裸花紫珠组显著高于凡士林纱布组及模型组(P<0.01)。见表2。

表1 两组体重变化

表2 各组创面愈合率比较

2.3各组创面组织病理学对比 治疗后第3天，正常组较多炎症细胞浸润，同时有少量毛细血管及纤维细胞生长；
裸花紫珠组有较少炎症细胞浸润，有少量毛细血管及纤维细胞生长；
凡士林纱布组有较多炎症细胞浸润，同时有少量纤维细胞及新生毛细血管；
模型组有少量炎症细胞浸润和纤维细胞生长，并没有显著的新毛细血管。治疗后第7天，正常组有较多炎症细胞浸润，纤维细胞生长活跃，毛细血管数量较前增加；
裸花紫珠组可见大量炎症细胞浸润，纤维细胞和毛细血管生长活跃；
凡士林纱布组有较多炎症细胞浸润，纤维细胞和新生毛细血管数量增加；
模型组可见较多炎症细胞，有少量纤维细胞和新生毛细血管。见图1。

图1 各组组织病理学(HE染色，×400)

2.4各组创面组织中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表达 干预后第3和7天，正常组、凡士林纱布组及裸花紫珠组创面组织中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表达均较模型组明显升高，且正常组及裸花紫珠组明显高于凡士林纱布组(P<0.05)。见表3、表4、图2。

表3 各组创面组织中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平

表4 各组创面组织中IGF-1、IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平

1～4:正常组、模型组、凡士林纱布组、裸花紫珠组图2 Western印迹检测各组创面组织、IGF-1、 IGF-1R、PI3K、Akt、eNOS、VEGF、VEGF2蛋白

世界上大约有3.82亿成年人患有糖尿病，约1.25%的足部糖尿病溃疡可能导致截肢〔6〕。DFU常由外周肾病和外周血管疾病的缺血而发生，其治疗主要包括清创及愈合过程〔7,8〕。DFU在中医中属于“脱疽”范畴。中医认为，该病的关键病机在于气血不足致新肉难生，故治疗关键为“祛瘀生新”〔9〕。现代研究显示，新生血管能为创面的愈合提供必要的血氧供应，促进创面组织生长，所以增加创面组织中新生毛细血管的数量是治疗本病的关键〔2〕。裸花紫珠颗粒的主要成分为中药裸花紫珠，系马鞭草科植物裸花紫珠的叶内含缩合鞣酸、酚类等，能明显抑制多种致病微生物，还能使毛细血管通透性降低、收缩血管，能明显的抑制炎症渗出及肿胀；
据报道，一些化合物可以显著缩短小鼠的出血、凝血时间，可以通过内源性凝血途径〔10〕。本实验病理结果提示，经裸花紫珠提取物外敷治疗后，DFU模型大鼠创面组织血管生成旺盛。而根据RT-PCR研究结果，裸花紫珠促进血管生成的机制可能与IGF-1/PI3K/Akt信号通路有关。

VEGF是一种可通过提高活化因子和抑制因子-l的表达，提高血浆酶原活化因子的活性，促进蛋白水解，进而加速新生毛细血管的形成的高度特异性的促血管内皮细胞生长因子〔11〕。IGF-1是一种在分子结构上与胰岛素近似的多肽蛋白。可通过诱导相关细胞因子的表达，推动创面组织修复〔12〕。研究显示，IGF-1在糖尿病患者体内浓度低下，是DFU创面难以愈合的重要原因〔13〕。

创面愈合的过程除了需要各种细胞和细胞因子进行参与之外，还有必要通过复杂的信号通路调节细胞内各种基因的表达，PI3K/Akt 信号通路是与细胞生长密切相关的信号途径，该信号通路在调节细胞生长、增殖、凋亡方面具有重要作用〔14〕。研究表明，糖尿病皮肤溃疡的发生与 IGF-1 密切相关，IGF-1 能促进成纤维细胞增殖和分化，有效增加胞外基质如胶原、聚葡萄糖胺、纤粘连蛋白等合成及分泌。机体长期处于高糖状态使 IGF-1 的表达减少，影响溃疡修复。而因 IGF-1R 对 IGF-1 的高亲和力，可通过检测 IGF-1R 来提示 IGF-1 的表达情况〔15〕。据研究显示，IGF-1能特异性结合IGF-1R激活PI3K/Akt信号通路〔16〕，进而磷酸化多种激活因子如eNOS〔17〕，参与血管生成的各个环节。同时磷酸化的Akt能提高VEGF主要功能受体VEGFR2的表达，增强VEGF的生物学活性〔18〕。本研究结果提示，裸花紫珠可能通过调控IGF-1/PI3K/Akt信号通路，增加组织中VEGFR2释放，达到促进血管生成的目的。

综上，裸花紫珠对于DFU具有良好的治疗作用，大多是通过调节IGF-1/PI3K/Akt信号通路来上调组织中的基因表达水平，促进成纤维细胞和新生儿毛细血管增殖，改善伤口的血液循环，使上皮细胞加速生长，最终有效促进伤口组织修复，可作为DFU外用配方进行深入研究。

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