抗磷脂抗体与青壮年缺血性脑卒中相关性的研究进展

杨 洋，高刘民

脑卒中已成为我国居民死亡的首要病因，发病率居高不下，其中85%的脑卒中病人为缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)[1]。IS主要的病因包括大动脉粥样硬化、心源性栓塞和脑小血管疾病[2]，但部分病人病因尚未明确[3]。这种病因不明的IS在45岁以下的青壮年群体更常见[4]，占比为20%～30%[5]。相关研究报道，卵圆孔未闭合并房间隔动脉瘤、颈动脉夹层可能是青壮年发生IS的主要原因[4，6]，仍有其他潜在的病因尚未明确。近年来，随着研究的不断深入，许多学者发现IS病人外周血清抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies，aPL) 升高，两者的相关性研究日益受到重视，现对两者的相关性进行综述。

aPL是血清中以磷脂、磷脂结合蛋白及其复合物为靶抗原的一组异质性自身抗体[7]。实验室中，aPL大致分为两类，一类是通过抗心磷脂抗体或抗2糖蛋白Ⅰ(anti-β2glycoprotein Ⅰ，aβ2GPⅠ) 抗体等固相检测的抗体，另一类是通过延长磷脂依赖的凝血试验检测到的抗体，称为狼疮抗凝剂[8]。目前关于非标准的aPL纳入其中，如抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体、抗β2-糖蛋白Ⅰ结构域1(anti-β2glycoprotein Ⅰ domain-1，aβ2GPⅠ D1) 抗体及抗膜联蛋白A5抗体、抗膜联蛋白A2抗体、抗蛋白C抗体和抗蛋白S抗体等[9]。aPL持续存在是抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)特征性实验室指标，APS是一种以反复的血栓形成和妊娠并发症为特征的全身性自身免疫性疾病，尽管APS相关性血栓好发于静脉系统，同时涉及动脉系统，神经系统是受累严重的部位，IS是常见的临床特征[10-12]。

aPL主要靶点是β2糖蛋白Ⅰ(β2glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ) ，这是一种与磷脂表面强烈结合的血浆蛋白，是天然的抗凝物质，在结构域Ⅴ与磷脂结合后构象发生改变，诱导aβ2GPⅠ产生并结合成复合物，促进血栓形成[13]。抗凝血酶原是aPL的第二主要抗原靶点。aPL相关性血栓形成研究中，狼疮抗凝剂与血栓形成的风险相关[14]。一项检测非标准aPL的大型回顾性研究表明，aβ2GPⅠ是动脉血栓形成的最佳预测因子[9]，可能与多数aPL的靶点均为β2GPⅠ有关。

多项研究发现，IS病人血清aPL阳性率升高[15-16]。既往发生IS的病人中，aPL阳性率高达13.5%[17]。一项对复发性脑梗死和首发性脑梗死病人的研究发现，aPL与复发性脑梗死关系密切[18]。

虽然aPL阳性可能出现在任何年龄的IS病人中，由于老年人其他血管危险因素的影响，无法判断老年病人aPL阳性和IS发病率之间的联系[19]。相较而言，aPL阳性与青壮年IS的相关性相对直观，有研究表明，45岁以下的中风病人中，超过20%的中风与APS有关[20]，aPL阳性的IS病人发病平均年龄为45.8岁，低于总体IS病人[21]。一项与APS相关脑卒中系统回顾研究显示，50岁以下的受试者中出现aPL阳性，使血栓性脑血管事件的发生风险增加5.48倍[22]。

原位血栓形成是aPL引起IS的常见致病机制[23]，且aPL可能导致青壮年过早发生动脉粥样硬化，从而引发IS。aPL引起IS的机制基于aPL干扰内源性抗凝(破坏膜联蛋白A5的抗凝屏障、抑制蛋白C途径或抑制抗凝血酶)，激活血管细胞(内皮细胞、单核细胞、血小板和免疫细胞)，并诱导细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs) 释放，增强黏附分子和组织因子表达，同时补体级联反应激活，参与IS的发生进展过程，最终在凝血系统和抗纤溶系统共同作用下形成血栓。

根据APS血栓形成的“二次打击”模型，潜在的内皮损伤和氧化应激增加与aPL抗体共同作用才能形成血栓[24]。与氧化应激和炎症相关的因子，可能在IS中发挥着重要的作用。来自瓣膜病变的栓塞物可能与另一种病因机制有关，这解释了脑血管远端病变[25]。

3.1 干扰抗凝系统

3.1.1 蛋白C系统 在APS中，aPL干扰蛋白C系统是导致血栓形成的机制之一。蛋白C通过与内皮跨膜蛋白、血栓调节蛋白结合被激活，活化蛋白C(activated proteic C，APC) 与血小板或内皮细胞表面的辅因子蛋白S形成复合物，共同灭活活化凝血因子Ⅴ和Ⅷ发挥抗凝作用[26]。抗蛋白C抗体既可直接抑制凝血酶/血栓调节蛋白复合物对蛋白C的激活，又抑制APC对活化因子Ⅴ的灭活。β2GPⅠ可直接与APC结合并使其失活，αβ2GPⅠ通过增强这种结合抑制其活性。多数凝血酶原-抗凝血酶原抗体免疫复合物通过干扰APC对活化因子Ⅴ的失活促进血栓形成[27]。

3.1.2 膜联蛋白A5膜联蛋白A5是一种存在于内皮细胞的钙依赖性磷脂结合蛋白，通过与细胞表面的磷脂结合形成保护性的抗凝血屏障，阻止促凝血复合物激活[28]。在膜联蛋白A5与其抗体相互作用情况下，这一屏障可能受损，导致血栓形成[29]。

3.2 激活血管细胞 内皮细胞、血小板和单核细胞是血栓形成的关键效应细胞，aPL 证明可激活内皮细胞、单核细胞和血小板，导致血栓表型形成[30]。aPL可直接结合内皮细胞膜和单核细胞膜受体，诱导跨膜组织因子蛋白表达，激活内皮细胞释放黏附分子、内皮素-1、炎性细胞因子和纤溶抑制剂等，并通过降低组织因子途径抑制物活性上调组织因子活性[27]。细胞因子失衡和组织因子上调可能是aPL相关性血栓形成的潜在机制。血管细胞通过释放EVs至细胞外环境中，通过增加炎症、凝血和内皮功能障碍改变止血平衡，促进血栓形成。

3.2.1 激活内皮细胞 正常的血管内皮表现为抗血栓表面，aPL与内皮细胞表面β2GPⅠ受体结合介导血管病变，介导的步骤包括弥漫性内膜增生、加速动脉粥样硬化和内皮功能障碍。注射到小鼠体内的人类aPL在无内皮损伤情况下不会促进血栓形成[31]，表明aPL和潜在的内皮功能障碍是APS血栓形成的必要“第一次打击”，但需要炎症性“第二次打击”诱发血栓形成事件。

aPL抗体，特别是抗心磷脂抗体和αβ2GPⅠ通过激活磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt) 途径及哺乳动物雷帕霉素复合物靶标诱导内皮细胞增殖和内膜增生[32-33]。aβ2GPⅠ介导氧化低密度脂蛋白内化，与β2GPⅠ复合成巨噬细胞，形成泡沫细胞，导致过早动脉粥样硬化病变的发展。小鼠动脉粥样硬化模型表明，aβ2GPⅠ可能通过增加非高密度脂蛋白/高密度脂蛋白比值干扰脂质代谢，加速动脉粥样硬化进程，并观察到aβ2GPⅠ诱导的动脉粥样硬化斑块中可见平滑肌细胞减少，导致斑块更易破裂[34]。aβ2GPⅠ D1在动脉粥样硬化病变中驱动Th1型炎症反应，继而导致斑块不稳定，最终导致动脉粥样硬化血栓形成[35]。aPL介导的内皮一氧化氮合酶抑制，舒张因子一氧化氮生成和释放受损，引起内皮功能障碍[36]。aβ2GP与β2GPⅠ结合导致内皮细胞活化，且aβ2GPⅠ激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，导致p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)磷酸化和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活。NF-κB活性增加可诱导组织因子、血管细胞黏附蛋白-1、细胞间黏附分子-1表达上调，血栓调节蛋白表达下调，最终形成血栓。

3.2.2 激活单核细胞 单核细胞表面主要β2GPⅠ受体为膜联蛋白A2，膜联蛋白A2不是跨膜蛋白，不能招募下游信号分子，只能与TLR4形成共受体，在脂筏中被αβ2GP-β2GPⅠ复合物招募和激活，从而诱导组织因子和炎性细胞因子[肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1和IL-6]在单核细胞中表达[37-38]。单核细胞通过p38MAPK和丝裂原活化蛋白激酶激酶-1(mitogen-activated proteinkinase kinase 1，MEK1)/细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路激活NF-κB，上调组织因子表达[39]。aPL与内皮蛋白C受体结合，在细胞表面加载溶二磷脂酸，并触发内皮蛋白C受体-溶二磷脂酸复合物与aPL的内吞作用，复合物破坏受抑制的组织因子，从而诱导凝血活化，引发单核细胞中的自分泌蛋白酶激活受体信号传导，将酸性鞘磷脂酶转移到细胞表面激活，促使单核细胞的促凝血表型改变[40-41]。

3.2.3 激活血小板 血小板的激活是APS血栓形成中的重要步骤。aPL中aβ2GPⅠ抗体与血小板活化的关系密切[38]。aPL激活血小板的激活有两种方式，第一种是aβ2GPⅠ-β2GPⅠ复合物通过血小板膜糖蛋白Ⅰbα亚基和血小板表达的载脂蛋白E2受体使p38MAPK磷酸化，促使血小板、血栓烷A2、血栓烷B2、P选择素和血小板因子4(platelet factor 4，PF4)释放，并活化血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[42]；
第二种是通过PF4与β2GPⅠ结合，形成稳定的复合物PF4-β2GPⅠ-aβ2GPⅠ，通过血小板膜糖蛋白Ⅰbα亚基和载脂蛋白E2受体进一步激活血小板。aβ2GPⅠ-β2GPⅠ复合物激活PI3K/Akt通路和下游的细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶，促进血小板黏附和聚集[27]。Verhenne等[43]在大脑中动脉闭塞的小鼠脑卒中模型中发现，内皮细胞分泌血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)，活性vWF与血小板膜糖蛋白Ⅰbα亚基结合，介导血小板黏附。aβ2GPⅠ通过抑制β2GPⅠ与vWF竞争性结合，增加循环中活性vWF水平；
同时抑制血管性血友病因子裂解酶-13活性，抑制体内vWF降解[42]。

3.3 EVs 有研究显示，由aβ2GPⅠ刺激内皮细胞释放的EVs水平增加了2倍[44]，提示EVs可能参与aPL血栓的形成。在EVs上暴露促凝血剂丝氨酸磷脂和组织因子，使其具有较强的促血栓形成功能[45]，丝氨酸磷脂和组织因子共存时，EVs的促凝血活性增强。

内皮细胞、单核细胞、血小板被激活后可释放EVs[46]，且补体激活可促使EVs释放[47]。不同来源的EVs在功能上有所差异，内皮源性EVs有一个独特的miRNA图谱，似乎通过miRNA向Toll样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)呈递ssRNA激活内皮细胞[48]。内皮源性EVs通过诱导单核细胞上组织因子表达，促进单核细胞的促凝状态，通过抑制内皮细胞一氧化氮产生，引起内皮功能障碍。单核细胞源性EVs与内皮细胞相互作用，通过减少抗凝分子表达，增加黏附分子表达，通过转导miRNA改变内皮细胞的黏附性，诱导内皮细胞炎症。血小板源性EVs通过直接相互作用或通过miRNA和脂质刺激内皮细胞和单核细胞，通过miRNA介导增强细胞间黏附因子-1表达，增强白细胞间黏附。血小板源性EVs可影响细胞因子的产生(IL-1β、IL-6、IL-8)。血小板源性EVs通过反馈导致血小板激活和聚集[30，47]，同时观察到EVs作为一种自分泌/旁分泌信号机制，在单个组织的细胞间传播促凝表型[38]。

3.4 免疫细胞 在aPL相关的血栓形成病理机制中，免疫细胞作用常被忽视，特别是嗜中性粒细胞和树突状细胞对产生和维持aPL是必要的。已有研究表明，中性粒细胞在活性氧和TLR4参与下活化释放中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)诱导组织因子的表达和凝血酶的生成，这可能是aPL相关血栓形成的重要因素[13，49-50]，同时NETs中的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶抗体可降解组织因子途径抑制物，加速血栓形成[51]。一项关于循环中NETs与APC相互作用的研究发现，aPL阳性的病人NETs通过促进APC耐药性参与机体高凝状态[52]。Pérez-Sánchez等[53]体外研究发现，采用aPL-IgG处理中性粒细胞后，miRNA表达降低。这些miRNAs可降低组织因子信使RNA水平及血小板活性[54]。低水平的miRNA表达可能与激活的单核细胞Ⅰ型干扰素信号增强有关[54-55]。

树突状细胞在APS中由内皮损伤引发的aPL持续产生中发挥重要作用[56]，这种机制可能是通过aPL与先天免疫细胞上表达的内皮蛋白C受体-溶二磷脂酸复合物的结合维持干扰素和TLR7依赖性B1a细胞扩增相关[40]。

3.5 补体激活 aPL介导的补体激活和凝血途径之间的交叉作用，共同作用于血栓形成。有研究显示，发生IS事件的APS病人血浆补体活化产物水平高于非APS相关IS病人[27]，表明补体参与aPL相关的IS发生。磷脂酰丝氨酸是一种带负电荷的磷脂，在血小板和内皮细胞活化后从细胞膜内迁移到外细胞膜[16]，之后通过β2GPⅠ表面受体，如载脂蛋白E2受体、膜联蛋白A2或Toll样受体，与aβ2GPⅠ-β2GPⅠ结合激活经典的补体途径。Chaturvedi等[57]测量补体的前瞻性研究发现，aβ2GPⅠ可能通过凝集素途径抑制β2GPⅠ对C3/C3b的降解作用，从而激活补体。补体激活生成C5a和膜攻击复合物C5b-9，C5a可诱导黏附分子表达及单核细胞、中性粒细胞和血小板活化，导致促炎介质释放，并启动促黏性和血栓前状态。C5b-9在内皮的沉积导致内皮损伤和促凝血剂改变，包括黏附分子表达、vWF分泌和EVs释放[58-60]。补体激活通过上调凝血酶激活纤溶抑制物水平，抑制纤溶反应[61]。

3.6 干扰纤溶系统 纤溶是在纤溶酶作用下将富含纤维蛋白的血栓修饰或分解成纤维蛋白原降解产物的过程，特异性纤溶酶原激活物抑制剂在纤溶酶原激活剂水平抑制纤溶系统。

在内皮细胞表面上，膜联蛋白A2与S100钙结合蛋白A10形成异四聚体复合物，该复合物作为促纤维蛋白溶解受体，结合纤溶酶原和组织纤溶酶原激活剂并促进血管纤维蛋白溶解[62]。完整的β2GPⅠ可促进纤溶酶产生。抗膜联蛋白A2抗体和aβ2GPⅠ通过两种机制促进血栓形成：首先通过抑制纤溶酶形成，其次通过诱导内皮细胞活化和组织因子表达，促进凝血和纤维蛋白形成[63-64]。Weiss等[65]建立的小鼠模型发现，抗膜联蛋白A2抗体对血栓形成和纤维蛋白溶解的影响与aβ2GPⅠ不同，表明抗膜联蛋白A2抗体是aPL相关血栓形成的独立危险因素。

aPL作为自身免疫系统疾病中常见的一类抗体，是导致青壮年IS的常见原因，aPL通过激活各类血管细胞并诱导EVs释放，致使细胞因子失衡和组织因子上调，导致脑血管动脉粥样硬化和内皮功能障碍，最终在补体、凝血和抗纤溶系统的共同作用下形成动脉血栓，从而发生IS，其中补体系统的激活和相关免疫通路发挥着重要作用，是今后发病机制研究的重点方向。

目前对aPL相关的IS治疗方法，除了控制脑血管事件的传统高危因素，如高血压、糖尿病、吸烟、肥胖和高脂血症等，对初次血栓的预防应采用个体化风险分层方法，添加小剂量阿司匹林、羟氯喹和他汀类药物等个性化方案，在预防继发性血栓形成方面，中等强度的华法林是主要治疗策略。随着对aPL引发IS机制的进一步探讨，尤其是补体系统的激活和相关免疫通路方面，为预防和治疗aPL相关IS提供新的治疗思路和策略，目前新型疗法如靶向B细胞和补体抑制等药物已用于临床，仍需更多的前瞻性临床研究进一步证实。

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