地塞米松在体外通过自噬减少亨廷顿蛋白积聚

程 丹，谭其莲，陈利海，蒋婷婷，朱骏生，尹海玲，王晓亮

（南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院） 麻醉科，江苏 南京 210001）

亨廷顿舞蹈（Huntington′s disease， HD）是一种常染色体显性的神经退行性遗传病，由it-15基因外显子1发生CAG三核苷酸重复突变，引发其编码的亨廷顿蛋白多聚谷氨酰胺序列延长所致［1］。目前突变亨廷顿蛋白导致大脑特定区域产生神经退行性病变的机制尚不明确，在神经元中正常的亨廷顿蛋白与神经系统发育和抑制细胞凋亡密切相关，而突变亨廷顿蛋白可以加工成有毒的化合物从而导致细胞死亡，突变亨廷顿蛋白错误的折叠以及异常聚集是引起HD的重要机制［2-3］。

真核细胞内有两种降解途径，一种是泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome，UPS），一种是自噬溶酶体通路（autophagy-lysosome pathway system，ALP）［4-5］。积聚的突变亨廷顿蛋白主要通过自噬途径降解［3］。自噬是溶酶体依赖的细胞内进程，待降解物质首先被自噬体吞噬，然后呈递给溶酶体降解［6］。一些自噬激活剂可以上调自噬，从而对HD起治疗作用［7］。地塞米松是临床上最常使用的一种合成糖皮质激素，研究表明地塞米松可以引发自噬［8］。关于地塞米松是否影响突变亨廷顿蛋白的积聚尚不清楚，以及与自噬的关联尚未阐明。因此，本研究探讨细胞水平上地塞米松是否影响突变亨廷顿蛋白的积聚，以及自噬在其中所起的作用。

1.1 材料

PC12、GFP-Htt（Q74）-PC12细胞获赠于中国科学技术大学温龙平教授。主要试剂及来源：胎牛血清（FBS）购于杭州四季青公司；
DMEM培养液购于美国Gibico公司；
兔抗LC-3（1∶200稀释，NB100-2220）单克隆抗体购于美国Novus Biologicals公司；
小鼠抗β-actin抗体（1∶1 000稀释，60008-1-Ig）和小鼠抗GFP抗体（1∶1 000稀释，66002-1-Ig）购于武汉Proteintech公司；
羊抗小鼠IgG抗体（1∶10 000稀释，ab6808）购于美国Abcam公司，羊抗兔FITC抗体（1∶100稀释，SC2-12）；
Lipofectamine 2000 （11668-019）购于加拿大Invitrogen公司；
3-甲基腺嘌呤（3-MA）购于美国Sigma公司；
BCA试剂盒购于碧云天生物公司；
地塞米松购于上海阿拉丁公司。主要仪器：Olympus BX53荧光显微镜，奥林巴斯公司；
Amersham Imager 600凝胶成像仪，美国通用公司；
Allegra64R离心机，贝克曼库尔特公司；
YCP-100细胞培养箱，长沙华曦科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和稳定转染细胞的获得 将PC12细胞培养于DMEM（含10%FBS，青霉素G100 μg/mL，链霉素100 μg/mL）培养基中，并置于37 ℃含 5% CO2培养箱中培养，培养皿中细胞生长密度为2×104～4×104个/cm2，每3～4 d更换培养基一次。通过Lipofectamine 2000转染PC12细胞，使PC12细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）融合的突变亨廷顿蛋白（Q74），转染的细胞用0.6 mg/mL的G418培养基进行筛选，每3天更换培养基一次，经3～4个月的传代选择和亚克隆后获得稳定表达GFP-Q74的细胞株，在荧光显微镜下呈现绿色荧光的即代表突变亨廷顿蛋白。

1.2.2 药物处理 PC12细胞分为对照组（加入溶剂25 mg/mL DMSO）、地塞米松组（加入地塞米松60 nmol/L）、3-MA组（加入3-MA，2.5 mmol/L）和3-MA+地塞米松组（同时加入地塞米松和3-MA），药物处理36 h后观察突变亨廷顿蛋白以及自噬水平的变化。

1.2.3 蛋白印迹实验检测突变亨廷顿蛋白的表达 将收集的细胞加入裂解液中裂解，然后加入样品缓冲液并煮沸10 min，通过BCA法测定样品浓度。使用聚丙烯酰胺凝胶100 V恒压电泳分离样品蛋白，电泳持续1.5 h，然后将电泳后的凝胶与硝酸纤维素膜叠在一起，在350 mA、1.5 h条件下转移至膜上，将膜置于5%脱脂牛奶中封闭1 h，之后分别加入相应的一抗β-actin抗体（1∶1 000）和GFP抗体（1∶1 000）4 ℃过夜，次日在摇床上用TBST洗膜3次，之后加入二抗羊抗小鼠IgG抗体（1∶10 000）37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次后，将ECL显色液加入膜上显影，由Amersham Imager 600凝胶成像系统采集并记录，Image J图像分析软件系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值反映蛋白表达水平。

1.2.4 免疫荧光检测观察突变亨廷顿蛋白积聚 收集细胞用4%多聚甲醛固定10 min，再用0.1%TritonX-100透膜10 min，TBST洗3次后，用1%FBS封闭1 h，加入一抗兔抗LC-3（1∶200）4 ℃条件下孵育过夜，次日TBST洗3次，后加入二抗羊抗兔FITC 抗体（1∶100），在37℃孵育1 h，TBST洗三次后使用80%甘油封片，之后通过荧光显微镜观察。

1.3 统计分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni法，两两比较采用t检验，P＜0.05统计学差异显著。

2.1 免疫荧光检测显示地塞米松减少突变亨廷顿蛋白聚集

稳定表达GFP-Htt（Q74）的PC12细胞中，聚集的突变亨廷顿蛋白在荧光显微镜下观测，表现为绿色荧光聚集。实验结果显示，地塞米松处理后，细胞内绿色荧光聚集显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），如图1所示。

2.2 地塞米松引发自噬

微管相关蛋白3（LC3）是自噬体的标志物，从荧光显微镜下观察，对照组中LC3均匀分布，而地塞米松组细胞内出现显著的LC3点状聚集，提示地塞米松引发了细胞自噬，如图2所示。

2.3 免疫荧光检测显示抑制自噬阻断地塞米松对突变亨廷顿蛋白积聚的影响

荧光显微镜下观察表明：相比对照组，自噬抑制剂3-MA处理后，细胞内绿色的GFP-Htt（Q74）显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；
相比地塞米松组，3-MA+地塞米松组细胞内积聚的GFP-Htt（Q74）显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05），而相比3-MA组，3-MA+地塞米松组细胞内及积聚的GFP-Htt（Q74）没有显著变化，说明地塞米松作用被阻断，如图3所示。

2.4 蛋白印迹检测表明地塞米松减少突变亨廷顿蛋白的表达

稳定表达GFP-Htt（Q74）的PC12细胞中，经地塞米松处理36 h，通过蛋白印迹检测GFP-Htt（Q74）含量，实验结果显示，与对照组相比，地塞米松组GFP-Htt（Q74）含量显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01），如图4所示。

图1 荧光显微镜观察经地塞米松处理的PC12细胞中GFP标记的突变亨廷顿蛋白积聚的变化Fig.1 Fluorescence microscopy observation of changes in the accumulation of GFP-tagged mutant Huntingtin in PC12 cells treated with dexamethasone

图2 荧光显微镜观察地塞米松处理36 h的PC12细胞自噬标志物LC3分布、形态变化Fig.2 Fluorescence microscope observation of the distribution and morphological changes of the autophagy marker LC3 in PC12 cells treated with dexamethasone for 36 h

2.5 蛋白印迹检测表明抑制自噬阻断地塞米松对突变亨廷顿蛋白表达的影响

蛋白印迹检测Htt（Q74）含量，相比对照组，3-MA组细胞内Htt（Q74）显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；
相比地塞米松组，3-MA+地塞米松组细胞内Htt（Q74）显著增多，差异有统计学意义，而相比3-MA组，3-MA+地塞米松组细胞内Htt（Q74）量没有显著变化，如图5所示。

HD基因编码的亨廷顿蛋白在细胞和组织中都有广泛表达［9］。正常的亨廷顿蛋白主要存在细胞质内［9］，但突变亨廷顿蛋白常形成聚集物，包括核内聚集物和神经毡胞质聚集物，细胞质和细胞核内突变亨廷顿蛋白聚集物都有细胞毒性，可导致细胞死亡［10］。本研究表明地塞米松可以显著减少细胞质中突变亨廷顿蛋白的积聚程度并减少GFP-Q74代表的突变亨廷顿蛋白的含量，这说明地塞米松可能延缓或治疗亨廷顿舞蹈病。

糖皮质激素是机体内极为重要的一类调节分子，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，地塞米松是临床上常用的合成糖皮质激素，容易透过血脑屏障进入脑组织中，研究表明地塞米松可以增加热休克因子1（HSF1），增强热休克反应，减缓亨廷顿疾病的进展［11］。此外糖皮质激素可以选择性对抗内质网应激引起的细胞凋亡，使糖皮质激素在亨廷顿舞蹈病的果蝇模型中发挥神经保护作用［12］。而本研究的结果从细胞水平上证明了地塞米松可以减少积聚的突变亨廷顿蛋白，更进一步的阐明了先前的研究，以及地塞米松对亨廷顿病的治疗机制。

图3 荧光显微镜观察加入自噬抑制剂3-MA对地塞米松处理的细胞中突变亨廷顿蛋白积聚改变Fig.3 Fluorescence microscopy observation of changes in the accumulation of mutant Huntingtin in dexamethasone-treated cells with the addition of autophagy inhibitor 3-MA

图4 蛋白印迹检测经地塞米松处理的PC12细胞中GFP标记的突变亨廷顿蛋白表达的变化Fig.4 Changes in the expression of GFP-tagged mutant Huntingtin in dexamethasone-treated PC12 cells detected by western blotting

HD患者中自噬功能是受到破坏的，突变亨廷顿蛋白可以损伤自噬，最新的研究还表明正常的亨廷顿蛋白也可以调节自噬，并对维持自噬功能起到重要作用［13］。抑制正常亨廷顿蛋白和亨廷顿相关蛋白1（HAP1）都可以阻断自噬体的逆向转运，而突变亨廷顿蛋白可以干扰自噬体的囊泡运输，阻断自噬体和溶酶体融合，从而破坏自噬功能［14］；
突变亨廷顿蛋白还可以抑制T淋巴细胞转录调节因子核转位损害自噬降解功能［15］。微管相关蛋白3（LC3）是自噬体的标志物，在自噬过程中，当自噬过程被激活，LC3Ⅰ被剪切形成分子量较小的LC3Ⅱ，并且聚集到自噬体膜表面，进而包裹待降解物形成完整的自噬体，最后结合溶酶体形成自噬溶酶体，使待降解物被降解，从而达到物质的循环再利用［5-6］。本研究证明地塞米松可以引发自噬，减少积聚突变亨廷顿蛋白含量，自噬抑制剂3-MA可以进一步增加异聚突变亨廷顿蛋白含量，并可以阻断地塞米松作用，说明地塞米松可能是通过自噬途径增加突变亨廷顿蛋白降解，从而减少异聚突变亨廷顿蛋白含量。

综上所述，地塞米松减少异聚的突变亨廷顿蛋白，从而可能缓解和治疗HD，地塞米松同时引发自噬，抑制自噬阻断地塞米松的作用，说明自噬可能是地塞米松减少积聚突变亨廷顿蛋白的分子机制。

图5 蛋白印迹检测加入自噬抑制剂3-MA对地塞米松处理的细胞中突变亨廷顿蛋白表达的变化Fig.5 Changes of mutant Huntingtin protein expression in dexamethasone-treated cells detected by adding autophagy inhibitor 3-MA by western blot

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