Drop-off微滴式数字PCR检测急性髓系白血病NRAS基因突变及其临床应用

向鹤麟， 金晔， 袁倩， 姚冬明， 李婷， 于迪， 冷加燕， 林江， 钱军,

(江苏大学附属人民医院 1. 血液科， 2. 中心实验室，江苏 镇江 212002；

3. 镇江市血液病临床医学研究中心，江苏 镇江 212002)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类以造血干祖细胞异常增殖的恶性克隆性疾病，细胞遗传学异常和分子改变已成为AML诊断分型的重要依据[1]。部分基因突变如核磷蛋白-1(NPM1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、CCAAT增强子结合蛋白(CEBPA)等已被纳入预后分层体系，其中NPM1突变因其克隆的稳定性也逐渐成为NPM1突变阳性的正常核型AML(CN-AML)微小残留病(measurable residual disease，MRD)监测的重要分子标志[2]。RAS信号通路基因突变如FLT3、神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)、Kristen大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)等是驱动髓系肿瘤的晚期事件，尽管目前没有被视为MRD监测的重要分子，但化疗后获得完全缓解时仍为阳性的患者复发率更高、无复发生存时间更短[3]；
此外，欧洲白血病网络MRD工作组也建议将NRAS基因突变与其他分子标志一起用于MRD监测[4]。本研究旨在建立一种检测NRAS突变的新型drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术，并初步探讨其在AML患者中的应用价值，以期应用于临床样本检测。

1.1 样本选择

回顾性检测2010年1月至2018年9月就诊于江苏大学附属人民医院血液科且根据当时FAB、WHO诊断分型标准确诊为AML患者(非M3)的骨髓血来源的DNA样本，其中男77例，女63例，中位年龄57.5岁。样本纳入标准：年龄不小于18岁；
初诊时未经过化疗诊治的骨髓血样本；
具有完整的病例信息；
签署过知情同意书的患者。不符合上述标准的患者被排除在研究之外。本研究经医院伦理委员会批准(伦理审查审批件号：K-20180063-Y)。

1.2 分离骨髓单个核细胞以及提取DNA

初诊AML患者就诊时抽取骨髓血，EDTA管抗凝，使用中国TBD Science公司生产的Ficoll分离液，提取骨髓单个核细胞。DNA提取采用美国Thermo Fisher公司生产的Trizol分离试剂完成。

1.3 引物和探针的设计

根据GenBank上目标基因序列(Gene ID：4893)，使用Primer 3设计针对NRASG12/G13突变位点的上游引物：5′-TTGCTGGTGTGAAATGACT-3′；
下游引物：5′-ATGGTGGGATCATATTCATCT-3′；
针对NRASG12/G13突变位点序列的野生型探针：5′-FAM-CCAACACCACCTGCTCCAAC-BHQ1-3′，突变位点外序列的野生型探针：5′-VIC-TTGGGAAAAGCGCACTGA-BHQ1-3′。引物和探针由上海华大基因有限公司合成。

1.4 drop-off ddPCR反应体系配置

反应体系含3.5 μL 10×dPCR反应缓冲液、1 μL dPCR酶、0.7 μL上下游引物、1 μLNRAS突变位点序列野生型探针、1 μLNRAS突变位点外序列野生型探针和5 μL待测DNA模板，去离子水补足体积至35 μL，反应试剂由江苏圣极基因科技有限公司提供。使用BioDigital Loader S100样本处理系统，制备装有微滴的芯片，将芯片置于Cycler S100 PCR扩增仪芯片槽内，进行如下反应：50 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，62 ℃ 40 s共45个循环，25 ℃保持。取出芯片移至Imager S100生物芯片阅读仪上，通过检测FAM和VIC信号进行结果分析，计算该基因突变频率。突变频率=[1-突变位点序列野生探针所测拷贝数(即FAM通道所示拷贝数)/突变位点外序列野生探针所测拷贝数(即VIC通道所示拷贝数)]×100%。数字PCR反应试剂盒和芯片由江苏圣极基因科技有限公司生产。数字PCR反应仪器由上海小海龟科技有限公司提供。

1.5 空白检测限和最低检测下限的建立

根据NCCLS-EP-17A指南，重复检查空白样本和极低浓度样本，计算出该方法的空白限及最低检测下限，并根据CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》对该方法进行验证[5-6]。检测的空白样本为该基因突变阴性的临床样本，低浓度样本为在野生样本的背景下，加入已知的突变样本。为提高芯片的利用率以及结果的准确性，将所有检测临床样本通过DNA比色仪定量在50 ng/μL(VIC通道信号检测的拷贝数约为10 000)。

1.6 重复性试验

每个样本均进行重复检测3次，统计检测结果并计算变异系数(coefficient of variation，CV)。

1.7 统计分析

使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0进行数据处理和统计分析，通过Spearman检验对理论突变负荷与实测突变负荷进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 drop-off ddPCR检测NRAS基因突变的方法学建立

2.1.1 特异性及准确性的验证 特异性验证：使用drop-off ddPCR重复检测野生型质粒(5次/d，检测2 d)，FAM和HEX通道为阳性，且各通道的拷贝数基本一致，特异性验证通过。准确性验证：使用drop-off ddPCR对突变型质粒进行多次反复检测(5次/d，检测2 d)，FAM通道为阴性，而HEX通道为阳性；
对杂合性质粒进行检测，FAM和HEX通道为阳性，计算突变频率与杂合性质粒突变比例一致，即准确性验证通过。

2.1.2 线性及检测限的验证 通过对阴性样本、低浓度突变样本分别进行36次重复检测，CV<5%，计算出该方法的空白限为5.40拷贝数/μL，最低检测下限为15.84拷贝数/μL。在已知突变频率的突变型样本中加入野生型样本，将突变频率进行稀释，分别将突变样本梯度稀释成含25.00%，5.00%，1.00%，0.20%，0.04%的NRAS突变，应用drop-off ddPCR对稀释后的不同突变频率的样本进行检测。每个浓度重复检测3次，取每次实测的平均值，检测结果见图1。理论稀释后的突变频率与实测突变频率的平均值呈良好的线性关系(R2=0.999，P<0.001)，见图2。对突变频率在0.2%以上的样本能够很好地检出。制备16拷贝数/μL的样本进行重复检测，分2 d，10次/d，20次均能检出阳性，检测阳性率为100%，且CV<5%，故drop-off ddPCR检测NRAS突变检出限验证通过，且对16拷贝数/μL以上浓度的样本检测的线性及重复性良好。

图1 drop-off ddPCR检测不同浓度梯度NRAS基因突变图

图2 不同浓度梯度的NRAS基因突变理论与实测值之间的相关性分析

2.2 应用drop-off ddPCR检测临床样本

对既往已行Sanger测序检测140例初诊AML患者DNA样本进行drop-off ddPCR检测，检测出NRAS基因突变的患者共28例(20%)，其中Sanger测序仅检出7例(5%)阳性(表1)，2例既往也有二代测序(NGS)结果证实存在NRAS基因突变，该7例标本ddPCR检测NRAS突变频率为21.69%～52.85%(中位突变频率为42.20%)；
Sanger测序阴性的21例标本drop-off ddPCR检测NRAS突变频率为0.26%～9.64%(中位突变为1.46%)。Drop-off ddPCR与Sanger测序法检测NRAS基因突变结果的阴性符合率为100%，阳性符合率为25%，总体符合率为85%。为了验证结果的可靠性，将该21例样本进行NRAS基因二代测序，结果揭示14例样本中存在阳性突变(突变频率1.03%～9.50%，中位突变频率4.35%；
测序深度179X-3708X，中位测序深度674X)，其中6例G12S(c.34G>A)、1例G12C(c.34G>T)、1例G12D(c.35G>A)、1例G12V(c.35G>T)、3例G13V(c.38G>T)、2例G13D(c.38G>T)；
该14例患者drop-off ddPCR检测突变频率为0.26%～9.64%(中位突变频率为2.82%)，将所有二代测序检测的突变频率与drop-off ddPCR检测突变频率进行相关性分析，结果如图3所示。7例样本NGS未检出突变(表2)，而drop-off ddPCR检测突变频率为0.53%～1.50%(中位1.10%)，见图4。

表1 drop-off ddPCR和Sanger测序检出NRAS基因突变的结果统计

表2 drop-off ddPCR和二代测序检测NRAS基因突变的结果统计

图3 二代测序检测的突变频率与drop-off ddPCR检测突变频率进行相关性分析

图4 drop-off ddPCR检出NRAS突变阳性而二代测序结果阴性的示意图

RAS蛋白在细胞生长和血管生成等信号传导通路中起重要调控作用。在血液系统肿瘤中，NRAS突变可高达10%～30%，其基因突变位点多发生在第12/13/61密码子[7]。目前临床上关于AML相关基因突变的检测主要采取二代测序技术和PCR技术[8-9]。二代测序技术通量性高，可用于全基因组测序，但由于其技术性较强，费用昂贵，耗时较长，现阶段难以用于单个基因突变的筛选以及后续的动态监测，同时现有的二代测序技术检测基因突变的灵敏度有限、在通常的测序深度下仅为1%～3%。对于超低频突变可能需要采用更加深度的测序，目前低于1%的基因突变检测在临床上没有广泛应用。现有的ddPCR技术是一种强大的基因检测技术，可以用于低频突变的检测，操作简便，能够实现绝对定量，但常规ddPCR仅可对已知突变进行检测，并且对不同类型突变的检测较为烦琐，需根据不同的突变类型设计特异性的探针，不能用于未知突变的检测[10-11]。而本研究建立的drop-off ddPCR能够对NRAS基因G12/G13位点突变区域存在的不同突变类型进行筛选，利用一条位于突变位点的野生型探针和一条位于突变位点外的野生型探针，即可检测出该热点突变区域存在插入、缺失、替换等突变，可用于对初诊AML患者存在NRAS基因G12/G13突变进行初筛。

本研究建立了drop-off ddPCR检测NRAS基因突变的方法，评价了该方法的准确性、特异性、灵敏度和可重复性，并对该方法的检测限进行了验证。通过对野生型质粒和突变型质粒以及杂合型质粒进行反复多次检测来验证该方法的准确性和特异性。通过野生型质粒和突变型质粒进行线性关系构建，用临床样本进行验证，重复3次，其线性结果良好(R2=0.999，P<0.001)。本研究建立的drop-off ddPCR检测初诊AML患者NRAS基因不同类型突变的特异性强，其临床样本检测的空白限为5.40拷贝数/μL，突变频率占总拷贝数的0.054%，最低检测下限为15.84拷贝数/μL，突变频率占总拷贝数的0.158%。对该检出限进行验证，检测阳性率为100%。该检出限的建立，有助于对初诊AML患者NRAS基因G12/G13位点突变进行检测，为提供个体化治疗方案提供思路[12-13]。

建立drop-off ddPCR对NRAS基因热点突变区域可能出现的不同突变类型进行初筛，应用该技术对140例连续性初诊AML患者(除外急性早幼粒细胞白血病)进行初筛，检测出28例NRAS基因突变的阳性样本，检出率(20%)明显高于Sanger测序(5%)。应用NGS对这21例Sanger阴性、drop-off ddPCR阳性的样本进行验证，NGS在21例样本中检出NRAS突变基因为14例，NGS阳性标本drop-off ddPCR也均检出，二者检出的突变频率具有良好的相关性。该结果证实drop-off ddPCR敏感性明显优于Sanger测序和NGS，NGS在AML群体中的漏检率达5%(7/140)。可以直观地从drop-off ddPCR检出NRAS突变阳性而NGS结果阴性的示意图中看到明显的突变液滴聚团，drop-off ddPCR检测出突变频率为0.53%～1.50%(中位1.10%)，这可能是在常规测序深度下，NGS灵敏度只有1%～3%，导致该7例低频突变未检出。对于不同类型的碱基突变，drop-off ddPCR能够更快更高效地进行初筛，同时该方法有助于对单个基因突变及时监测。

综上，本研究建立了drop-off ddPCR检测AML患者NRAS基因突变的方法，该方法具有良好的灵敏度和可重复性，可用于对初诊AML患者NRAS基因突变的筛选及预后判断，并且有潜在的可能与其他分子标志联合应用于MRD监测。

本研究也有一定的局限性：首先，本研究属于回顾性研究，在样本的选择上有一定的限制，导致后期对样本的随访不全；
其次，NGS技术对于临床样本的检出下限在正常测序深度上为1%～3%，而drop-off ddPCR的灵敏度可达到0.16%，但由于两种技术之间的检测突变频率的方法以及计数的差异，对于低频突变无法进行更深层次的验证，而且这种低频突变所导致的亚克隆型白血病细胞群体以及该基因突变能否与NPM1等基因联合监测MRD有待进一步研究。

猜你喜欢拷贝数基因突变探针线粒体DNA拷贝数变异机制及疾病预测价值分析河北医学(2021年10期)2021-10-27管家基因突变导致面部特异性出生缺陷的原因中国生殖健康(2020年2期)2021-01-18胎儿染色体组拷贝数变异与产前超声异常的相关性分析中国临床医学影像杂志(2019年6期)2019-08-27基因突变的“新物种”小学生导刊(2018年13期)2018-06-29管家基因突变导致面部特异性出生缺陷的原因中国生殖健康(2018年2期)2018-01-12多通道Taqman-探针荧光定量PCR鉴定MRSA方法的建立现代检验医学杂志(2016年3期)2016-11-15HBV相关性肝细胞癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数差异分析中华实验和临床病毒学杂志(2016年3期)2016-08-09BOPIM-dma作为BSA Site Ⅰ特异性探针的研究及其应用三峡大学学报(自然科学版)(2016年6期)2016-04-16透射电子显微镜中的扫描探针装置物理实验(2015年9期)2015-02-28线粒体DNA拷贝数的研究新进展医学综述(2014年24期)2014-03-08