LncRNA,ABHD11-AS1在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其机制

徐春晖， 王慧之， 刘雅雯， 李政， 龚爱华， 徐岷

(1. 江苏大学附属医院消化科，江苏 镇江 212001；

2. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

胰腺癌发病隐匿，进展快，预后差，生存期短[1]，5年生存率不足10%。目前治疗早期胰腺癌的最有效方案是手术切除后辅助化疗[2]，但肿瘤易对传统化疗药物耐药。其中，细胞凋亡抵抗是耐药产生的重要机制[3]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指长度超过200个碱基对，同时缺乏蛋白编码能力的RNA。据报道，lncRNA在人类细胞中广泛表达，可以通过与DNA、RNA和蛋白质的相互作用，调控细胞信号转导，维持肿瘤恶性表型，促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及耐药等[4-5]。α/β-水解酶结构域蛋白11的反义链1(α/β-hydrolase domain containing protein 11-antisense strand 1，ABHD11-AS1)基因位于7号染色体，其在胰腺癌[6]、结直肠癌[7]和卵巢癌[8]等多种肿瘤中呈高表达，促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭。在胰腺癌中，ABHD11-AS1可作为潜在早期诊断标志物，与传统肿瘤标志物CA19-9联合检测可获得良好的诊断效果，并且ABHD11-AS1高表达患者往往预后不良[6]。

铁死亡自2012年发现以来[9]，被认为是细胞最广泛的程序性死亡方式之一[9-10]。最新研究表明，联合使用铁死亡诱导剂可减弱吉西他滨化疗的耐药性[11]，易产生耐药性的癌细胞对可能铁死亡特别敏感[12]。Erastin作为铁死亡诱导剂，抑制胱氨酸谷氨酸转运受体，阻碍胱氨酸吸收，导致谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性降低，进而引起脂质过氧化，导致细胞铁死亡。已有动物实验表明，Erastin在30～60 mg/kg剂量范围内有明确的抑癌作用且无明显不良反应[13]。90%以上的胰腺癌患者携带KRAS基因突变，而Erastin对于KRAS突变癌细胞的杀伤作用具有高选择性和敏感性等特点[14]，因此对于胰腺癌的治疗，Erastin有很大潜在临床可行性。近年来，已证实包括microRNA和circRNA在内的lncRNA参与铁死亡的生物学过程[15]，从而影响了癌症的进展和治疗。因此，本研究拟探讨lncRNA ABHD11-AS1对于Erastin引起胰腺癌细胞铁死亡的影响及其作用机制。

1.1 生物信息学分析

通过基因表达在线分析平台GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析lncRNA ABHD11-AS1在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达水平，筛选条件“gene：ABHD11-AS1”；
“Datasets：PAAD”；
“Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data”；
“Log Scale：Yes”；
“Jitter Size：0.4”。

采用GEPIA分析ABHD11-AS1和胰腺癌患者生存率相关性，筛选条件“gene：ABHD11-AS1”“Methods：Overall Survival”；
“Group Cutoff：Quartile”；
“Cutoff-High：75%”；
“Cutoff-Low：25%”；
“Datasets Selection：PAAD”。取胰腺癌患者ABHD11-AS1表达量的四分位数，表达量25%以下的为低表达组，75%以上的则为高表达组。

1.2 细胞、主要试剂和仪器

人胰腺癌PANC1、MIApaca-2、Patu8988细胞由江苏大学医学院2508实验室于液氮罐中保存。DMEM高糖培养基、PBS、超敏ECL发光液购自美伦生物技术有限公司；
胎牛血清购自美国Gibco公司；
铁死亡挽救剂Ferrostatin-1、坏死挽救剂Necrostatin-1、凋亡挽救剂Z-VAD-FMK和Erastin购于美国Med Chem Express公司；
ABHD11-AS1质粒和对照质粒购自长沙优宝生物科技有限公司；
siRNA购自广州锐博生物科技有限公司；
Trizol购自日本TaKaRa公司；
牛血清白蛋白购自德国Biofroxx公司；
雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)、GPX4抗体(兔抗人)购自美国Cell Signaling Technology公司；
二抗(羊抗兔)购自美国Santa Cruz公司；
2×SYBR Green Mix试剂、CCK8试剂购自南京诺唯赞科技生物股份有限公司；
GSH、丙二醛检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
BCA蛋白定量试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司；
Lipofectamine2000试剂、逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；
800 TS多功能酶标仪购自美国Bio Tek公司；
超净细胞操作台购自苏州净化设备公司；
SDS-PAGE电泳仪、荧光定量PCR仪购自美国Bio Rad公司；
细胞恒温培养箱购自上海医疗器械厂。

1.3 细胞培养

人胰腺癌PANC1、MIApaca-2、Patu8988细胞用含10%胎牛血清的DMEM，培养于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中。常规传代、冻存。

1.4 qRT-PCR检测3种胰腺癌细胞中ABHD11-AS1相对表达量

取生长状态良好的人胰腺癌PANC1、MIApaca-2和PaTu8988细胞，用Trizol提取细胞总RNA，按说明书使用逆转录试剂盒，合成相应的cDNA。PCR反应体系(10 μL)为4.1 μL DEPC水、5 μL 2×SYBR Green Mix和上、下游引物各0.2 μL、0.5 μL cDNA，加入8连管中。反应程序：95 ℃ 5 min(预变性)；
95 ℃ 20 s(变性)；
56 ℃ 20 s(退火)；
72 ℃ 30 s(延伸)，循环40次；
4 ℃存放。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：U6，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；
ABHD11-AS1，上游引物5′-TTGAGGGTAAGTGTTCTTCTGA-3′，下游引物：5′-CAGCAACATCAAAGCCGA-3′。以U6作为内参，ΔCt(所测细胞)=CtABHD11-AS1-CtU6，ΔΔCt(所测细胞)=ΔCt所测细胞-ΔCtPANC1，对应相对表达量即为2-ΔΔCt。后续实验中，选取ABHD11-AS1低表达PANC1细胞进行过表达实验，ABHD11-AS1高表达PaTu8988细胞进行干扰实验。

1.5 CCK8法检测并计算Erastin诱导不同胰腺癌细胞半数抑制浓度IC50

取处于对数生长期的人胰腺癌PANC1、MIApaca-2和PaTu8988细胞接种于96孔板，每孔4 000个细胞，每组设置3个复孔。次日细胞贴壁后，提前将Erastin用培养基稀释成不同浓度，根据不同细胞系，PANC1细胞选取0、1、2、4、8 μmol/L，MIApaca-2细胞选取0、2、4、8、16 μmol/L，PaTu8988细胞选取0、4、8、16、32 μmol/L，每孔加入100 μL Erastin稀释液，于培养箱培养72 h；
弃培养基，每孔加入100 μL CCK8反应溶液(90 μL无血清培养基+10 μL CCK8原液)，同时设立空白组(空白孔100 μL CCK8反应溶液)，孵育1 h；
用多功能酶标仪检测450 nm波长处D值。当前浓度下细胞活力(%)=(D当前Erastin浓度-D空白组)/(D0 μmol/L Erastin组-D空白组)×100%。所得数据用GraphPad Prism 7.0进一步计算IC50。为筛选出不同细胞株合适的Erastin加药浓度即IC50，初步分析IC50与ABHD11-AS1之间的关系，为下一步实验作基础。

1.6 质粒转染

将人胰腺癌PANC1细胞分为pcDNA3.1-ABHD11-AS1组和对照空载质粒pcDNA3.1组。取对数生长期PANC1细胞接种于6孔板，每孔约5×105个细胞，孵育12 h；
弃培养基，加入1 mL无血清培养基，将5 μL Lipofectamine2000试剂与100 μL无血清培养基混匀，将2 μg pcDNA3.1-ABHD11-AS1质粒或者对照pcDNA3.1质粒与100 μL无血清培养基混匀，将前两步所得液体混匀后静置20 min形成200 μL转染复合物，随后均匀滴入相应的6孔板，4～6 h后换成含有10%胎牛血清培养基。

1.7 siRNA转染

将人胰腺癌Patu8988细胞分为siControl、siRNA1和siRNA2 3组。取处于对数生长期的Patu8988细胞接种于6孔板，每孔约5×105个细胞，孵育12 h；
弃培养基，加入1 mL无血清培养基，将5 μL Lipofectamine2000试剂与100 μL无血清培养基混匀，将3 μL siControl、siRNA1或siRNA2与100 μL无血清培养基混匀，将前两步所得液体混匀后静置20 min形成200 μL转染复合物，随后均匀滴入相应的6孔板，4～6 h后换成含有10%胎牛血清的培养基。si-NC靶序列为GACTCAGGTACGGAGACCA，siRNA1靶序列为TGCTCCCTGGAGGTCCAAATA，siRNA2靶序列为CACCTGACAGCAACATCAAAG，其中siRNA1和siRNA2均为干扰ABHD11-AS1表达设计的siRNA，二者靶序列不同。

1.8 qRT-PCR检测lncRNA ABHD11-AS1相对表达量

取“1.6”和“1.7”转染后的细胞，培养箱中培养48 h后，qRT-PCR检测转染效率，具体方法同“1.4”。

1.9 CCK8法检测PANC1、Patu8988细胞经不同药物处理后的细胞活性

取“1.6”和“1.7”转染后48 h的细胞，予以对照(0 μmol/L Erastin)及Erastin(细胞IC50)处理；
其中，pcDNA3.1-ABHD11-AS1组和siRNA1组额外予以Erastin+Ferrostatin-1、Erastin+Necrostatin-1、Erastin+Z-Vad-FMK处理，在培养箱中共孵育72 h；
采用CCK8检测细胞活性，方法同“1.5”。Ferrostatin-1、Necrostatin-1、Z-Vad-FMK浓度为1 μmol/L，PANC1和Patu8988细胞所加Erastin浓度分别为2.245、17.120 μmol/L。

1.10 ELISA法检测丙二醛和GSH相对表达量

取“1.6”和“1.7”转染后48 h的细胞，将pcDNA3.1组、pcDNA3.1-ABHD11-AS1组、siControl组、siRNA1组、siRNA2组共5组细胞予以对照(0 μmol/L Erastin)及Erastin(细胞IC50)处理，在培养箱中共孵育72 h；
按照相应检测试剂盒说明书，检测丙二醛和GSH相对值，采用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度。实验组丙二醛相对表达量=实验组丙二醛值/对照组丙二醛值；
实验组GSH相对表达量=实验组GSH值/对照组GSH值。

1.11 蛋白免疫印迹法检测p-mTOR、mTOR和GPX4蛋白表达量

取“1.6”和“1.7”转染处理并培养72 h的胰腺癌细胞，加入蛋白裂解液后刮取蛋白，100 ℃煮沸10 min；
随后12 000×g离心10 min，取上清液。配置10%SDS-PAGE电泳凝胶，每个泳道加入20 μL样品；
50 V电泳45 min，110 V电泳60 min；
300 mA转膜150 min将蛋白转移至PVDF膜；
5%牛血清白蛋白常温封闭1 h；
4 ℃兔抗人一抗(GPX4抗体、p-mTOR抗体、mTOR抗体、内参β-微管蛋白，1 ∶1 000稀释)孵育过夜；
次日TBST漂洗3次，每次10 min；
加入HRP标记的二抗常温孵育1 h；
TBST漂洗3次；
用超敏ECL发光液将条带在电子凝胶成像仪上显影拍照，用Image J软件计算条带灰度值。

1.12 统计学分析

2.1 ABHD11-AS1在胰腺癌中的表达和生存分析

从GEPIA分析TCGA和GTEx数据库，其中胰腺癌患者179例，健康对照者171例；
与正常胰腺组织相比，ABHD11-AS1在胰腺癌组织中表达明显增高(P<0.05，图1A)。在胰腺癌患者中，ABHD11-AS1高表达组总体存活率明显低于低表达组(HR=2.5，P<0.05，图1B)。由此可见，ABHD11-AS1过表达与胰腺癌患者不良预后相关。

A：GEPIA分析胰腺癌组织和正常胰腺组织中ABHD11-AS1相对表达量；
B：ABHD11-AS1高表达组和低表达组生存曲线；
*：P<0.05

2.2 不同胰腺癌细胞系中ABHD11-AS1表达量与Erastin诱导铁死亡半数致死量

qRT-PCR结果显示，ABHD11-AS1在人胰腺癌PaTu8988细胞中表达最高，MIApaca-2细胞次之，PANC1细胞中最低(F=34.13，P<0.05)，见图2A。由图2B-D所示，通过GraphPad Prism 7.0可计算PANC1、MIApaca-2、Patu8988细胞的IC50分别为2.245、11.760、17.120 μmol/L，其对Erasin的抵抗程度与胰腺癌细胞系ABHD11-AS1表达量呈正相关。根据ABHD11-AS1相对表达量，选取PANC1细胞转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-ABHD11-AS1质粒进行过表达实验，对应Erastin实验浓度为2.245 μmol/L；
选取PaTu8988细胞转染siControl、siRNA1、siRNA2小干扰RNA进行干扰实验，对应Erastin实验浓度为17.120 μmol/L。

A：qRT-PCR检测ABHD11-AS1相对表达量；
B-D：CCK8法检测Erastin处理后PANC1、MIApaca-2、PaTu8988细胞活性；
#：P<0.05，与PANC1细胞相比；
*：P<0.05，与0 μmol/L Erastin组相比

2.3 上调ABHD11-AS1表达致胰腺癌PANC1细胞发生铁死亡抵抗

qRT-PCR检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1组ABHD11-AS1相对表达量显著升高(t=3.636，P<0.05，图3A)。如图3B-D所示，经Erastin处理后，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1组细胞活性及GSH含量明显增高，而丙二醛含量明显降低(t=7.492，6.033，2.807，P均<0.05)。pcDNA3.1-ABHD11-AS1组经Erastin处理后额外加入Z-VAD-FMK或Necrostatin-1，细胞活性无明显差异(t=0.575，0.751，P均>0.05)，而加入铁死亡挽救剂Ferrostatin-1后，细胞活性明显升高(t=8.432，P<0.01，图3B)，表明lncRNA ABHD11-AS1通过抵抗铁死亡挽救Erastin处理的细胞活性，而非凋亡或者坏死。由此可见，ABHD11-AS1表达增高可对Erasin引起的铁死亡产生抵抗。

2.4 干扰ABHD11-AS1表达致胰腺癌PaTu899细胞对铁死亡敏感

如图4A所示，与siControl组相比，siRNA1、siRNA2组细胞ABHD11-AS1相对表达量明显降低(t=5.403，7.103，P均<0.05)。如图4B-D所示，经Erastin处理后，与siControl组相比，siRNA1、siRNA2组细胞活性及GSH含量明显降低，而丙二醛含量明显增高(P均<0.05)。siRNA1组经Erastin处理后额外加入Z-VAD-FMK或Necrostatin-1，细胞活性无明显差异(t=0.042，0.414，P均>0.05)，而加入铁死亡挽救剂Ferrostatin-1后，细胞活性明显升高(t=19.010，P<0.05，图4B)，表明抑制lncRNA ABHD11-AS1表达可通过增敏铁死亡导致Erastin处理的细胞活性降低，而非凋亡或者坏死。由此可见，抑制ABHD11-AS1表达可增敏胰腺癌细胞铁死亡。

A：qRT-PCR检测pcDNA3.1和pcDNA3.1-ABHD11-AS1组ABHD11-AS1相对表达量；
B：CCK8检测不同药物处理后细胞相对活性；
C：ELISA法检测还原型谷胱甘肽含量；
D：ELISA法检测丙二醛含量；
*：P<0.05

A：qRT-PCR检测siControl、siRNA1和siRNA2组ABHD11-AS1相对表达量；
B：CCK8检测不同药物处理后细胞相对活性；
C：ELISA法检测还原型谷胱甘肽含量；
D：ELISA法检测丙二醛含量；
*：P<0.05

2.5 lncRNA ABHD11-AS1促进胰腺癌细胞p-mTOR和GPX4蛋白表达

蛋白印迹结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1组胰腺癌PANC1细胞p-mTOR、GPX4表达和p-mTOR/mTOR比值明显升高(P均<0.05)；
与siControl组相比，siRNA1、siRNA2组胰腺癌PaTu899细胞p-mTOR、GPX4表达和p-mTOR/mTOR比值明显降低(P均<0.05)。见图5。siRNA1和siRNA2是ABHD11-A1不同靶序列的小干扰RNA，其中siRNA1拥有更高的干扰效率，其对应的p-mTOR、GPX4表达和p-mTOR/mTOR比值较siRNA2更低，进一步佐证了ABHD11-AS1对p-mTOR和GPX4蛋白表达的调控。由此可见，ABHD11-AS1可促进胰腺癌细胞mTOR活化和铁死亡关键抑制因子GPX4表达。

A：蛋白免疫印迹检测pcDNA3.1和pcDNA3.1-ABHD11-AS1组p-mTOR、mTOR和GPX4相对表达量；
B：蛋白免疫印迹检测siControl、siRNA1和siRNA2组p-mTOR、mTOR和GPX4相对表达量；
*：P<0.05，与pcDNA3.1组相比；
#：P<0.05，与siControl组相比

本文首先通过生物信息学结果发现，胰腺癌组织中ABHD11-AS1表达水平明显高于正常胰腺组织，ABHD11-AS1高表达组生存率明显低于低表达组。由此可推断，ABHD11-AS1在胰腺癌进展中起促癌作用。这也与相关研究[6]中ABHD11-AS1在胰腺癌中高表达并促进肿瘤的增殖侵袭相一致。

目前已有常见的铁死亡诱导剂Erastin和RSL3广泛用于实验之中[16]。由于Erastin对于KRAS突变的肿瘤细胞更加敏感[12]，而90%以上的胰腺癌存在KRAS突变，因此本研究以Erastin为铁死亡诱导剂，由此选择了3种KRAS突变的胰腺癌细胞PANC1、MIApaca-2、PaTu8988为实验对象，并通过Erastin成功诱导了铁死亡。国内外分别有研究已通过Erastin诱导了人胰腺癌PANC1[17]、MIApaca-2[18]、PaTu8988[19]细胞的铁死亡，本研究结果与其相符。在研究和评价药物时IC50是最重要的指标之一，IC50越低表明该细胞株对此药物更加敏感，同时IC50也是进一步实验时的加药浓度[20]。本研究采用IC50作为Erastin实验浓度，结果显示3种胰腺癌细胞IC50高低与ABHD11-AS1相对表达量趋势一致，提示二者可能存在相关性。本研究中Erastin引起的pcDNA3.1-ABHD11-AS1组和siRNA1组细胞活性降低可被铁死亡挽救剂抑制，而凋亡和坏死抑制剂无效，符合Erastin诱导铁死亡的特征[16]。本研究结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1组细胞活性和还原型GSH含量明显增高，丙二醛含量明显降低，表明ABHD11-AS1高表达可抵抗Erastin引起的铁死亡；
与siControl组相比，siRNA1和siRNA2组细胞活性和还原型GSH含量明显降低，丙二醛含量明显增高，表明抑制ABHD11-AS1表达可增敏Erastin引起的铁死亡。然而在上述过程中，胰腺癌细胞对Erastin铁死亡的敏感是否主要由ABHD11-AS1调控还有待证实。

铁死亡在多种药物的抗肿瘤过程中起重要作用，例如索拉非尼[21]、磺胺吡啶[22]、他汀类药物[23]和青蒿素[24]等药物通过引起铁死亡发挥作用。GPX4作为铁死亡的关键调控因子，可通过消耗谷胱甘肽从而降低质膜中的复合过氧化物[25]。GPX4一旦失效，即引发磷脂过度氧化，质膜破裂，细胞死亡[14]。本研究中ABHD11-AS1过表达可激活mTOR磷酸化并引起下游GPX4表达增高，干扰则相反。这可以从一定程度上解释ABHD11-AS1引起Erastin耐药的原因，但完整的机制还有待进一步挖掘。

综上所述，lncRNA ABHD11-AS1通过促进p-mTOR和GPX4表达，在人胰腺癌PANC1、PaTu8988细胞中引起铁死亡抵抗。然而，在上述过程中，ABHD11-AS1是否是影响胰腺癌细胞铁死亡的最主要因素还有待证实，且明确的调控机制还待进一步探索；
对于低表达ABHD11-AS1且存在传统药物耐药的患者，可予以Erastin抗癌治疗。

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