微波消解-连续流动分析法测定肉类食品中的磷

卢丽娟 赵 静 毕静莹

(1.西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌712100；
2.宁夏职业技术学院，宁夏 银川750021)

磷是生命活动中不可或缺的重要元素，参与生物体的物质代谢和能量代谢[1]，是牙齿、骨骼、细胞膜、核酸、磷蛋白及一些辅酶的组成成分[2]。但是，人体摄入过多磷时，也会引起多动症、呕吐和肾功能不全等。肉类食品磷含量高，极易被人体吸收利用，是很好的磷摄入来源[3]。同时，磷酸盐能提高肉的保水性和嫩度，在肉制品加工行业应用广泛，但是过量添加容易造成磷超标[4]。因此，准确检测肉类中磷含量对于指导肉类饮食、肉类食品的安全和质量控制具有重要意义。

目前，食品中的磷含量通常采用分光光度法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、连续流动分析法、近-中红外光谱融合技术或X射线荧光光谱法进行测定[5-8]。其中，连续流动分析法具有自动化程度高、分析速度快、准确度好、方法灵敏度高等优点[9-10]，在批量样品检测方面有很大优势，广泛应用于水体、植物、土壤等样品的磷含量检测。目前，连续流动分析法的样品前处理，通常采用干法灰化或湿法消解。然而，干法灰化消解时间长，而湿法消解易产生污染。微波消解作为一种新型的样品消解方法，具有试剂用量少、消解速度快、消解完全、元素无挥发性损失、操作简单等优点[11-15]，广泛应用于肉类食品中钙、镁等多元素的测定，但是，对于微波消解与连续流动法结合测定肉中磷含量的方法未见报道。

为了快速准确地测定肉类食品中的磷含量，本文采用微波消解法对肉类食品进行前处理，重点优化了微波消解酸体系、消解条件，并结合连续流动分析法进行测定，将前处理条件与后续测试条件相互配合，为肉类食品中总磷的测定提供更安全、准确的方案。

1.1 实验材料

牛肉、猪肉、鸡肉和鱼肉，产地均为陕西，购于杨凌示范区农贸市场。

1.2 仪器及工作条件

FLOWSYS型连续流动化学分析仪(Systea公司，意大利)，Multiwave PRO型微波消解仪(配有赶酸仪，安东帕有限公司，奥地利)；
AUY220型天平(感量0.1 mg，岛津(中国)有限公司)，FLOWSYS型连续流动化学分析仪仪器参数见表1。

表1 连续流动分析仪仪器参数

数据采集和处理软件：Syslyzers III1.6.14(Systea公司，意大利)。

1.3 主要试剂

硝酸、过氧化氢、钼酸铵、酒石酸锑钾、十二烷基磺酸钠、抗坏血酸、磷酸二氢钾，均购自上海国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；
实验用水为去离子水。

钼酸铵溶液：1.5 g钼酸铵溶于去离子水，稀释至100 mL，混匀。

硫酸溶液：将13.5 mL硫酸，缓慢加入去离子水中，并不断搅拌，冷却至室温，定容至100 mL。

酒石酸锑钾溶液：0.34 g酒石酸锑钾溶于去离子水，稀释至250 mL，混匀。

显色剂：将酒石酸锑钾溶液、钼酸铵溶液、硫酸溶液按照1∶2∶5的体积混匀，并加入润滑剂SDS溶液1 mL。

抗坏血酸溶液：1.35 g抗坏血酸溶于去离子水，稀释至50 mL，混匀。

标准储备溶液(1 000 mg/L)：0.439 4 g磷酸二氢钾溶于250 mL烧杯中，加入去离子水定容至100 mL，混匀；
标准溶液(50 mg/L，用标准储备溶液逐级稀释而成)。

1.4 样品制备

称取样品0.2 g(精确至0.000 1g)于微波消解罐中，加入6 mL硝酸，在赶酸仪上预消解30 min(温度100 ℃)，放上密封圈旋紧盖子，放入微波消解仪中，按设定好的微波消解程序进行消解(见表2)。消解完成后，在通风橱中缓慢拧开瓶塞，将消解罐放置于赶酸仪上进行赶酸(温度160 ℃)，赶酸至试样溶液剩余1 mL左右全部转移至50 mL容量瓶中，用去离子水清洗瓶塞，并将清洗液一并转移至消解罐中，最后用去离子水进行定容，同时做试剂空白对照。

表2 微波消解程序

采用微波消解法对肉类样品进行消解处理，并考察微波消解酸体系及酸用量、取样量、赶酸温度和消解液稀释倍数，消解处理后的样品放置时间等对磷含量检测结果的影响。

2.1 消解酸体系的选择

HNO3-H2O2是目前广泛应用于有机化合物的消解体系，其中的H2O2具有强氧化性，与浓硝酸共用，可以大幅度提高其氧化作用。但H2O2加入过多或样品有机化合物含量较高，在消解升温过程中会快速释放大量气体，使消解罐内压力急剧升高，容易导致样品泄露而影响测定准确度。因此，本研究分别选择了HNO3(6 mL)和HNO3-H2O2溶液(6 mL)作为肉类样品的消解体系，考察HNO3和HNO3-H2O2两种消解体系的消解效果以及对肉中磷提取量的影响。结果显示(图1)，牛肉、猪肉、鸡肉和鱼肉经过两种消解体系消解后的溶液均澄清透明，且没有残渣，这说明肉类样品可以被完全消解。因此，将硝酸体系作为后续微波消解提取磷元素的实验体系。

图1 不同消解体系的影响Figure 1 Influence of different digestion systems.

同时，对两种消解体系处理后的鸡肉样品磷含量进行检测，从表3可以看出，两种消解体系对检测结果影响不显著。因此，为了保证实验的安全性和准确性，选择HNO3体系对肉类样品进行消解。

表3 消解酸体系对测定结果的影响

2.2 消解酸用量的选择

根据密闭微波消解系统的操作要求，HNO3用量应不少于3 mL。硝酸具有强腐蚀性，因此为了尽可能减少其使用量，进一步考察了HNO3加入量对磷检测结果的影响。称取试样0.2 g(精确至0.000 1 g)于微波消解罐中，分别加入4、6、8、10 mL HNO3，按照实验方法处理样品后，使用连续流动分析仪进样检测。从表4可以看出，硝酸加入体积对磷的测定结果影响不显著。在消解过程中，由于预消解时硝酸会挥发一部分，因此当加入4 mL硝酸时，在消解过程中需补加硝酸，这增加了前处理工作量。而加入10 mL硝酸，后续赶酸时间会相对较长。综合试剂用量和后续赶酸时间，选择6 mL硝酸作为微波消解的酸用量较为合适。

表4 消解酸用量对测定结果的影响

2.3 赶酸温度对实验结果的影响

经过微波消解以后的样品，通常都要进行赶酸操作后再定容稀释，从而减少强酸对测试仪器的腐蚀。同时，连续流动法测定磷含量时，待测液的酸浓度对检测结果有较大影响。赶酸过程中设置的赶酸温度越高，硝酸挥发的越快，赶酸时间也就越短，但是太高的温度又可能会增加磷损失的可能性，从而影响检测结果。因此，本研究将赶酸仪的温度分别设置为120、180、210、240 ℃进行，直到消解液剩余1 mL后再定容。

从表5中可以看出，赶酸温度对磷含量的检测结果影响不显著。实验过程发现，设置120 ℃赶酸，所用时间5 h左右，设置240 ℃进行赶酸，所用时间1 h左右，随着赶酸温度的增加，所用赶酸时间逐渐减少。通常赶酸快结束时，会提前关闭赶酸仪电源开关，待消解液降至室温再定容。但是赶酸仪温度下降很慢，如果设置赶酸温度过高，当降至室温时可能消解酸体系硝酸已挥发完了，影响检测准确性。同时，微波消解罐材质是聚四氟乙烯，它的正常使用温度是-65～260 ℃，温度太高容易发生不可逆的变形。综合考虑，选择赶酸温度210 ℃较为合适。

表5 赶酸温度对实验结果的影响

2.4 取样量的选择

微波消解仪的操作手册中推荐的样品使用量为0.1～0.5 g。取样量的选择对检测结果的精密度影响较大。如果取样量少，则会放大检测过程中的不确定度，因此本研究考察了不同取样量对检测结果的影响。分别称取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g试样，加入6 mL硝酸，经过预消解、微波消解、赶酸、定容至50 mL后，进样检测。从表6可以看出，取样量0.05～0.5 g时，样品的精密度均在5%以内，这也说明微波消解在取样量较少的情况下，磷损失少，从而保证较高的准确性和重复性。考虑到取样均匀与代表性，应该取尽量多的样品，但是称样过多有机质含量高，增加了反应的剧烈程度，从而增加了预消解时间，加剧了微波消解反应罐的压力，以及后续样品的稀释倍数。综合考虑，选择0.1 g取样量较为合适。

表6 取样量对测定结果的影响

2.5 样品消解后的稀释程度对检测结果的影响

应用连续流动-磷钼蓝比色时，酸度对检测结果影响较大，酸度过高会造成显色不足[16]。经过微波消解的样品溶液含有高浓度硝酸，不能直接上机测定，因此需要通过赶酸使硝酸挥发剩余1 mL左右，随后加入去离子水稀释来降低待测液酸度。本研究考察了不同稀释倍数对检测结果的影响。称取试样0.2 g(精确至0.000 1 g)于微波消解罐中，加入6 mL硝酸，经过预消解、微波消解、赶酸至试样溶液剩余1 mL左右，分别定容至10、25、50、100、200 mL后，进样检测。

结果如表7所示，样品溶液稀释10和25倍，检测的磷含量偏低，精密度较差，同时样品峰形异常，这可能是酸浓度太高造成的；
当稀释50、100和200倍时，测定结果精密度较好，说明酸浓度合适，比色充分。但是，稀释倍数太大引入的实验误差也会增加。因此，一般选择稀释100倍即可，如果磷含量过高的样品，可以适当增加稀释倍数。

表7 消解液稀释倍数对测定结果的影响

2.6 待测液放置时间对实验结果的影响

连续流动分析仪一次可以测定100多个样品，而微波消解仪一般配置8～64个反应罐，一次最多可以消解64个样品，大批量检测时，为了节省检测时间，一般将微波消解定容液(待测液)先放在4 ℃冰箱保存，等所有样品前处理完毕，再集中进行连续流动分析测定。为了考察待测液中磷的稳定性，本研究将待测液放置在4 ℃冰箱，分别放置0、4、8、12、24、48、72、144 h后测定磷含量。由表8可知，待测液放置0～144 h，检测出的磷含量差异不显著，说明待测液中磷含量稳定性好。

表8 待测液放置时间对实验结果的影响

2.7 方法检出限与线性关系考察

优化后的微波消解-连续流动分析法测得样品质量浓度在0～4 mg/L范围内与吸光度呈一次线性关系，拟合得到线性回归方程y=0.1464x+0.0084，R2=0.9994，表明在此浓度范围内线性关系良好。

取10份磷含量为估计方法检出限值3～5倍的鸡肉样品，稀释10倍(使加标样品与检出限比值在3～5)按照以上优化的方法，测定磷含量，根据标准计算出检出限MDL=[t(n-1，0.99)]×S，其中n为样品的平行测定次数；
t为自由度为n-1，置信度为99%时t分布(单侧)，结果如表9所示，本方法检出限结果为0.041 g/kg。

表9 方法检出限

2.8 实际样品回收率和精密度实验

利用本研究所优化的样品消解条件和检测条件，选择牛肉、猪肉、鱼肉进行标准溶液加标回收实验，将10次测定的平均值作为测定结果，计算相对标准偏差(RSD)和回收率。结果见表10，精密度范围在2.5%～4.6%，加标回收率在92.5%～103%。表明优化后的方法精密度和准确度较高。

表10 精密度和回收率实验

本研究利用微波消解法提取肉中磷元素，选择了硝酸作为消解酸体系，并进一步优化了微波消解体系，研究显示硝酸使用量6 mL、样品用量0.1 g、赶酸温度210 ℃和消解液稀释倍数100倍，较为适合作为肉类样品的微波消解条件，同时也发现，经过消解处理后的样品4 ℃放置144 h以内，样品磷元素含量不变。利用优化后的样品消解条件对肉类样品进行处理，结合连续流动分析仪进行检测，测定结果表明方法检出限0.041 g/kg，加标回收率在92.5%～103%，测定结果的相对标准偏差小于5%，说明本研究建立的方法具有较高的准确度和精密度。

综上所述，采用微波消解-连续流动分析法测定肉类食品中磷的方法是可行的。此方法由微波消解进行样品处理，消解安全，试剂用量少，结合连续流动分析仪进行检测，分析速度快，准确度与精确度较高，适用于大批量的肉类样品磷含量的测定，为肉类食品中磷的安全监测与标准制定提供了参考依据。

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