中性粒细胞胞外诱捕网与肝癌关系的研究进展

张金金 周燕萍 胡作为

肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。根据2020 年全球癌症统计数据显示，原发性肝癌在全球范围内的新增病例约90.6 万，死亡病例约83 万［1］。据2022 年最新统计，在中国肝癌的发病率和病死率分别占据第四位和第二位［2］。代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是肝癌发生的重要危险因素，其发病率和流行率呈上升趋势，很可能超过病毒因素成为全球肝细胞癌（HCC）患者发病的主要原因［3］。虽然手术治疗、化学治疗、局部消融、分子靶向治疗等治疗手段显著提高，但由于早期症状隐蔽、发展快、侵袭强，肝癌患者平均生存时间仍然很短［4］。因此，迫切需要深入了解肝癌发生发展的分子机制，以提高临床的治疗效果。

中性粒细胞是先天免疫系统的关键参与者。中性粒细胞通过吞噬、脱颗粒、产生活性氧（ROS）和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）等不同机制来捕获或降解入侵的病原体［5］。然而，中性粒细胞可以增强循环肿瘤细胞的黏附性，通过分泌细胞因子和释放NET，促进肿瘤的生长和转移［5］。Brinkmann 等（2004 年）首次报道了IL-8、佛波酯或脂多糖刺激中性粒细胞后形成NET。NET 是由解聚的染色质和颗粒蛋白组成的网状结构，具有捕获和杀死病原微生物的作用［6］。NET 的形成被描述为一种独特的程序性细胞死亡方式，这一过程被称为中性粒细胞炎性凋亡（NETosis）［7］。据报道，NET 在肿瘤生长、转移及癌症相关血栓形成中发挥着重要的作用［8］。因此，本研究首先阐述了NET 的形成机制。其次，探讨了NET 在肝癌生长、侵袭、转移以及癌症相关血栓形成中的作用。笔者将根据最新的发现总结NET 在肝癌中的研究进展，为抗肿瘤治疗提供新的思路和方法。NET 作为抗肿瘤治疗的潜在靶点，在未来研究中具有广阔的前景。

1. NET 结构和形成

Takei 等（1996 年）首次报道了NET。NET 主要是核DNA 和颗粒蛋白组成的网状结构，该结构上装饰有中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）、组织蛋白酶G（CG）、白细胞蛋白酶3、乳转铁蛋白（LTF）等。高分辨扫描电子显微镜显示，NET 由直径为15～17 nm 的纤维和25～50 nm 聚集复合体的球形结构组成。迄今为止，多项研究已经揭示了NET 形成的不同途径。在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖或补体因子5a（C5a）刺激后，中性粒细胞以ROS 依赖的方式释放线粒体DNA 产生NET，NET 的产生促进了肿瘤进展的转移前生态位［9］。在金黄色葡萄球菌和佛波酯的刺激下，中性粒细胞核小叶形态消失，核膜破裂，去浓缩的染色质与细胞质和颗粒成分混合，内膜丧失导致细胞器消失，随后释放NET到细胞外空间，它的形成依赖于NADPH 氧化酶（NOX）产生的ROS［10］。在NETosis 形成过程中还涉及不同的受体，如Toll 样受体（TLR）、NOD 样受体、补体受体和趋化因子受体等［11］。

2. NET 形成的机制

2.1 NOX 依赖性NETosis

NET 的形成过程始于病原体和多种物质的刺激，如佛波酯、抗体、胆固醇晶体、脂多糖、IL类等，这些外来刺激激活中性粒细胞表面的特异性受体，细胞表面受体的激活导致蛋白激酶C（PKC）/Raf/MEK/ERK 激酶信号通路的活化和gp91phox 磷酸化，促进细胞内钙离子增加，从而激活NOX 的活性，随后产生ROS［12］。ROS 的产生触发NE 和MPO 解离。NE 从膜相关复合物解离进入胞浆，并依赖于MPO 激活其蛋白水解活性。在细胞质中，NE 可结合并降解F 肌动蛋白，然后再从嗜天青颗粒转移至细胞核。在那里NE 可降解部分核小体组蛋白，促进DNA 浓缩。随后，MPO 消耗过氧化氢（H2O2）生成次氯酸，协同增强染色质解聚。解聚的染色质进入胞质， GSDMD 诱导质膜破裂，驱动染色质排出细胞外空间，导致中性粒细胞死亡，释放出NET。此外，在这个过程中，肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）也被激活，在中性粒细胞中PAD4 高表达，催化组蛋白精氨酸残基转化为瓜氨酸，导致染色质去浓缩，核肿胀，核膜和质膜通透性增加，核层粘连蛋白形成网状结构，核膜和质膜破裂并释放细胞外DNA［13-14］。这个过程也称为NOX 依赖性NETosis。

2.2 NOX 非依赖性NETosis

中性粒细胞在金黄色葡萄球菌、革兰阳性杆菌等刺激下，迅速释放NET，这一过程中性粒细胞经历了明显的形态变化，表现为多叶细胞核变圆并浓缩，内、外核膜分离，囊泡出芽，囊泡内充满核DNA，然后将DNA 释放到细胞外空间。整个过程是一种独特的、快速的，不依赖于NOX 的途径。重要的是，在NET 释放后，中性粒细胞质膜未破裂，且无核中性粒细胞仍然存活并保持迁移和吞噬能力。此外，在微生物、钙离子载体A23187 和离子霉素等刺激下，中性粒细胞表面特异性受体（TLR4、TLR2 受体和补体受体3）被激活，与配体结合触发内质网中钙的释放，导致细胞内钙浓度增加，然后打开质膜钙通道，触发了中性粒细胞中线粒体ROS 的产生，并激活了小电导钙激活钾离子（SK）通道和PAD4［10］。PAD4 是一种瓜氨酸蛋白酶，它被激活后转移至细胞核，在那里PAD4 将精氨酸转化为瓜氨酸，瓜氨酸化的组蛋白所带正电荷减少，降低了组蛋白与带负电荷DNA 之间的亲和力，组蛋白从DNA 中解离，导致紧密的染色质结构丧失，最后染色质解聚［15］。这被认为是形成NOX 非依赖性NETosis 所必需的。此外，中性粒细胞用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子与脂多糖或C5a 联合刺激时，NETosis 的形成依赖于线粒体以ROS 的方式释放DNA。使用ROS 抑制剂二苯基氯化碘盐时，发现在相同条件下中性粒细胞线粒体DNA 释放完全阻断。因此，形成这种NET 的释放被认为是线粒体NET 或者NOX 非依赖性NETosis［16］。

NASH 是发展为肝癌的重要危险因素。据报道，NASH 患者血清中NET 标志物水平明显升高。van der Windt 等（2018 年）研究显示，在STAM小鼠模型中，肝脏中可见大量中性粒细胞浸润和NET 的形成，NET 的释放导致炎性细胞因子产生和肝癌进展。然而，脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）减少了STAM 小鼠中浸润性巨噬细胞和炎症因子的产生，抑制NASH 向肝癌进展。此外，在NASH 相关的HCC（NASH-HCC）中，NET 与幼稚的CD4+T 细胞表面TLR4 受体相互作用，启动代谢重编程，调节性T 细胞（Tr）分化，重塑免疫抑制微环境，促进NASH-HCC 的发生和发展。然而，在体内使用PAD4-/-小鼠或DNase I 可阻断NET 的形成，降低Tr 细胞的活性，预防NASH-HCC［17］。

肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的主要原因。Yang 等［18］在肝癌患者血清和肿瘤组织中观察到NET 标志物MPO-DNA 水平明显高于健康对照组。MPO-DNA 是癌症患者无复发生存期和总体生存期的独立预测标志物［19］。最近相关研究报道，在肝癌患者中，中性粒细胞以线粒体ROS 依赖的方式形成富含线粒体DNA 的NET，这些NET 可触发肿瘤炎症反应，促进肿瘤细胞侵袭和转移［20］。然而，NET 对肝癌增殖、侵袭和转移以及癌症相关血栓的形成中的具体机制知之甚少。Tohme 等（2016 年）报道，肿瘤细胞可以诱导中性粒细胞释放NET 促进手术应激后肝脏转移的发生和发展。NET 的主要成分DNA（NET-DNA）与肿瘤转移有关。NET-DNA 可能作为一种趋化因子来吸引肿瘤细胞导致远处转移。跨膜蛋白CCDC25 是肿瘤细胞上的一种NET-DNA受体，可感知胞外DNA，随后激活ILK-β-parvin-RAC1-CDC42 级联反应，促进肿瘤细胞黏附、增殖和迁移。敲除CCDC25 基因显著抑制了NET 对肿瘤细胞的黏附、迁移和细胞骨架重塑。使用DNase I 处理荷瘤小鼠，防止了NET 的形成和肝转移的发生［21］。在小鼠肝脏缺血/再灌注（I/R）模型中，血小板TLR4 以ERK5/整合素GP Ⅱb/Ⅲ a 依赖的方式诱导血小板活化和血小板-肿瘤细胞聚集体的形成，促进NET 捕获循环中的肿瘤细胞和手术应激后的远处转移。敲除TLR4 可以使小鼠免受肝脏I/R 模型中NET 诱导的转移潜能［22］。在盲肠穿刺不结扎的裸鼠模型中，中性粒细胞释放的NET 激活了TGF-β 信号通路，促进肿瘤细胞外渗，并植入肝脏和腹膜中，诱导肿瘤细胞增殖和转移。使用TGF-β 通路抑制剂LY2157299 可明显抑制肝脏和腹膜转移［23］。在体外，肿瘤浸润性中性粒细胞通过糖酵解和磷酸戊糖途径激活NOX-ROS 信号通路触发NET 的形成，NET 诱导HepG2 肿瘤细胞上皮-间充质转化，促进肿瘤细胞侵袭和迁移［24］。此外，肝癌细胞来源的CXCL8/IL-8 以NADPH 依赖的方式触发中性粒细胞释放NET，与NET 相关的CG下调了E-钙黏蛋白的表达，增加体外炎症因子水平，促进肿瘤细胞的侵袭。阻断PAD4 或抑制CG，减少了NET 的形成，削弱了肝癌细胞的侵袭和转移能力［25］。

门静脉血栓形成是HCC 患者预后不良的主要因素。据报道，HCC 患者，尤其是门静脉癌栓和肝外转移患者血清中MPO-DNA 水平明显高于健康对照组，并与肝癌的恶性进展有关［25］。Seo 等（2019年）在HCC 合并肝硬化患者中发现，接触系统标志物水平（Ⅻa）随着NET 的形成而逐渐升高，并与肝病严重程度呈正相关，这些标志物被发现是肝癌患者门静脉血栓的重要危险因素。NET 在肝脏I/R 后激活血小板诱导全身高凝状态，导致远处器官损伤和免疫血栓形成。然而，利用DNaseⅠ处理小鼠，减少了中性粒细胞浸润，阻止了NET 的形成，减轻和缓解肝脏I/R 后全身高凝状态和远处器官微血栓形成［26］。

最初NET 被认为是一种捕获和杀死病原微生物的防御系统。然而，近年来相关研究表明，NET在多种恶性肿瘤进展中发挥重要作用。本文主要阐述了NET 的形成机制以及其在肝癌中的作用，如上所述，某些外来刺激或细胞因子触发NET 的形成，NET 可以通过激活下游信号通路促进肿瘤发生发展。另外，NET 可以充当血栓支架，捕获和激活循环中的血小板，促进癌症相关血栓形成。靶向NET 是一种有前途的抗肿瘤治疗策略。深入了解NET 在肝癌发生发展中的机制，对抗肿瘤的治疗具有重大意义，为治疗方案的设计和新药物开发提供新思路。然而，目前关于NET 在肝癌的生长、转移和癌症相关血栓形成的机制屈指可数，在未来需要更多的临床、体内及体外实验进一步研究NET 与肝癌及其微环境的关系。

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