鸭腺病毒3型Fiber-2蛋白在酵母细胞中的表达及免疫原性研究

史琪雯,段进坤,陈爽,鲍恩东,杨燚,李守军*,马吉飞

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津 300392;2.天津瑞普生物技术股份有限公司,天津 300308)

腺病毒(Adenovirus,ADV)是一种无囊膜的线状双股DNA病毒,因其倾向于感染上皮细胞而得名[1]。目前,已知对鸭有致病性的腺病毒包括鸭腺病毒1型(DAdV-1)、鸭腺病毒2型(DAdV-2)和鸭腺病毒3型(DAdV-3)[2-3]。其中DAdV-1又称产蛋下降综合征病毒(EDSV),为富AT腺病毒属成员[4-5]。DAdV-2为禽腺病毒属成员,其代表为GR株,主要引起20～30日龄番鸭的发病,患病鸭出现以肝和脾肿大、出血为主要特征的病理变化[6-7]。DAdV-3于2014年分离于广东的一批患病番鸭[7],自发现该病毒后,在浙、闽、皖等各地的雏番鸭中也陆续发生该病。其造成的临床病理变化表现为肝纤维化、肿大、心包积液。DAdV-3对40日龄内的雏番鸭有严重的致病性,死亡率可达20%,且易与圆环病毒、细小病毒、弧肠孤等病毒混合感染鸭群,对不同时期的番鸭均能造成死亡。

本研究选用的病料来源于河北保定地区疑似鸭腺病毒3型传染病特征的番鸭养殖场,经过对病料基因组的提取,设计引物进行PCR扩增检测和测序分析,序列结果与NCBI数据库中DAdV-3 CH-GD-12-2014株(KR135164,GenBank ID)序列片段一致,综合送检和外源病毒检测结果,确定为DAdV-3。对比CH-GD-12-2014 和其他已知序列的禽类腺病毒后发现,其与禽腺病毒属的12个血清型不同;在相似度上,本毒株与DAdV-2 GR株有92.3%的同源性,与鹅腺病毒GoAdV-4 P29(JF510462)株有 60%的同源性[1]。虽与GR株有较高的同源性但CH-GD-12-2014株和GR株最有意义的不同点是CH-GD-12-2014株有fiber-1和fiber-2两个基因而GR株只有一个fiber基因,所以CH-GD-12-2014不为GR株分支。有研究表明,腺病毒的毒力变化与fiber基因相关[8-9],缺失fiber-1后会造成病毒产量下降,腺病毒受体的特异性转导作用下降;缺失fiber-2会导致病毒无法增殖、组装或扩散,不能产生病毒粒子[10]。DAdV-3 CH-GD-12-2014株的fiber-1基因片段大小为1 380 bp,fiber-2基因片段大小为1 443 bp,Yin 等[11]在大肠杆菌中表达了鸭3型腺病毒的Fiber-1和Fiber-2蛋白,根据免疫攻毒保护试验结果显示,重组Fiber-2蛋白免疫组所产生的抗体水平显著高于Fiber-1组。本试验利用在DAdV-3产生病毒粒子所必需的Fiber-2蛋白[1]在马克斯克鲁维酵母中进行表达,产物用于制备亚单位疫苗,鸭腺病毒病的防治提供物质基础。

1.1 质粒与菌种

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)TOP-1菌株、pUKDN115表达质粒由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院提供;pBlunt-fiber-2(含根据酵母密码子偏好性优化后的DAdV-3fiber-2基因)由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 试验材料

EscherichiacoliDH5α、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit、2x Rapid Taq Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Probe qPCR mix、限制性内切酶NotⅠ、SmaⅠ均购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒小提试剂盒、TMB单组份显色液、ELISA终止液均购自北京索莱宝科技有限公司;HRP标记的羊抗鸭IgG(H+L)购自KPL公司。

1.3 引物设计

选取NCBI数据库中DAdV-3 CH-GD-12-2014株(KR135164)的fiber-2基因序列,交由北京擎科生物科技有限公司优化、合成并连接pBlunt载体,命名为pBlunt-fiber-2。根据pBlunt-fiber-2载体中优化后的DAdV-3fiber-2基因序列设计无缝克隆引物DAdV-3-F/R(5′-TGTTAGATACTAGTCCCGGGATGAAGAG-AACCAAC-3′/5′-CGCCGGCGAATTCCGGCGTTTCTAACGTTAACTAA-3′)和通用鉴定引物PINU-F/R(5′-CAGCAATTAAATCCGGGGTAAG-3′/5′-TATAAAATGTCGCTGTGACCAGGC-3′)。

1.4 DAdV-3 Fiber-2蛋白在酵母细胞中的表达

1.4.1 重组表达载体的构建将pUKDN115表达质粒用NotⅠ/SmaⅠ进行双酶切,插入片段由pBlunt-fiber-2克隆载体质粒通过引物DAdV-3-F/R扩增获得,胶回收后用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit无缝克隆试剂盒进行重组连接,37 ℃反应1 h,转化入DH5α感受态细胞,培养、离心后涂布于含氨苄抗性的LB平板,37 ℃培养过夜。次日挑取单菌落,以PINU-F/R为鉴定引物,进行菌落PCR,筛选出阳性菌株,送至金唯智公司测序,将构建正确的重组表达载体命名为pUKDN115-fiber-2。

1.4.2 重组酵母表达菌株的构建挑取TOP-1酵母单菌落,接种至3 mL含20 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1酵母粉、20 g·L-1葡萄糖的YPD液体培养基中,30 ℃、200 r·min-1过夜培养至D600为12。取过夜菌液1 mL于1.5 mL EP管中,8 000 r·min-1离心1 min;弃上清液,加入1 mL无菌水洗涤,8 000 r·min-1离心1 min;弃上清液,加入1 mL 1×LiAc/TE重悬菌体,8 000 r·min-1离心1 min;弃上清液,菌体用1×LiAc/TE重复洗涤 1次;菌体中依次加入5 μL carrier DNA、1.5 μL pUKDN115-fiber-2质粒(500 ng)、600 μL PEG-3000溶液和1 mol·L-1DTT;充分混合后,30 ℃水浴15 min,再转入47 ℃水浴15 min;水浴结束后8 000 r·min-1离心 1 min;弃上清液,加入200 μL无菌水重悬菌体,吸取50 μL菌悬液涂布于SD-Ura平板,在30 ℃恒温箱培养72 h。以PINU-F/R为鉴定引物,挑取单菌落进行菌落PCR,以筛选阳性菌株。将验证正确的菌株命名为TOP-fiber-2(TOP-1-pUKDN115-fiber-2)。

1.4.3 重组蛋白的表达选取验证正确的菌株,接种于10 mL YPD液体培养基,30 ℃、200 r·min-1培养过夜;次日以1%的接种量将菌液转接至100 mL含20 g·L-1酵母粉、40 g·L-1葡萄糖的YD液体培养基中,摇床200 r·min-1、30 ℃培养72 h后,收集菌液,用PBS清洗菌体后重悬。菌液经高压均质仪破碎(1.2×105kPa,2次),将菌液离心反电泳验证后,收集上清液。

1.5 重组蛋白的SDS-PAGE、Western blot与琼脂凝胶扩散试验验证

将收集到的上清液通过SDS-PAGE和Western blot检测是否含有目的条带。配制含80 g·L-1NaCl、10 g·L-1琼脂糖的琼脂凝胶扩散板后打孔,将样品原液分别稀释2、4、8、16和32倍,每孔依次添加25 μL样品稀释液,中间孔添加25 μL DAdV阳性血清,孵育过夜,次日观察结果。

1.6 Fiber-2蛋白的高密度发酵、纯化及效价测定

将构建成功的重组菌株TOP-fiber-2接种YPD平板,30 ℃培养72 h;挑取单菌落接种至含有葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾等成分的种子培养基中,在30 ℃、200 r·min-1条件下培养16 h制备种子液;取50 mL种子液转接至含4.5 L发酵底料培养基的15 L生物反应器中进行高密度发酵。发酵控制参数为30 ℃,通气量7 L·min-1,初始转速为200 r·min-1,通过与搅拌转速联动控制溶氧量约20%,用氨水调节pH值为5.5。采用全料流加的方法补料,每隔6 h采取样品并检测。发酵结束后将样品用高压均质仪以1.2×105kPa破碎2次,离心,收集上清液,利用SDS-PAGE和琼脂凝胶扩散试验检测蛋白表达量。为降低浊度和纯化蛋白,将发酵液离心,用PBS清洗2次后弃上清液,用含0.75 mol·L-1NaCl的PBS缓冲液重悬,在高压均质仪中以1.3×103kPa压力破碎细胞2 次。8 000 r·min-1离心5 min,上清液用拦阻相对分子质量为1.0×105的超滤膜浓缩,再用0.2 μm微孔滤膜抽滤后得到蛋白溶液。用BCA蛋白定量试剂盒检测目的蛋白的浓度,1∶16～1∶256倍比稀释后进行琼扩试验测定效价。

1.7 DAdV-3 Fiber-2蛋白的免疫原性研究

将纯化后的蛋白溶液分别进行倍比稀释至1∶128和1∶64的琼扩效价浓度,然后以Marcol-52白油为佐剂配制成高、低剂量2种亚单位疫苗。将2日龄番鸭随机分为高剂量组(1∶128,抗原剂量每羽68 μg)、低剂量组(1∶64,抗原剂量每羽34 μg)、攻毒对照组和空白组,每组10只。试验组番鸭每只皮下注射 0.3 mL 疫苗,攻毒对照组与空白组不注射;免疫后第10天和第21天在各试验组中随机选取5只番鸭,采血清检测抗体水平。免疫后第21天,试验组与攻毒对照组的受试番鸭按照已建立的攻毒模型每只皮下注射DAdV-3病毒液2×105.5TCID50);攻毒后7 d收集肛拭子,检测各组受试番鸭的排毒水平。

收集的肛拭子置于含有3 mL PBS的离心管内,反复冻融3次,提取核酸。以表1中所示的DAdV-3-22K-F/R为引物扩增片段,并构建至pBlunt载体上作为标准品模板,倍比稀释后建立荧光定量PCR(qPCR)标准曲线。以提取的肛拭子基因组DNA为模板,用引物qDAdV-3-F/R及探针(表1),通过qPCR检测病毒含量。反应程序:95 ℃预变性30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40个循环。通过标准曲线计算肛拭子中的病毒含量。

表1 本研究所用引物及探针Table 1 Primers and probe used in this study

免疫后第10天和第21天分别对各试验组番鸭进行采血以检测DAdV 3特异性抗体。利用Fiber-2蛋白纯化包被ELISA板,包被蛋白浓度为1 μg·mL-1,每孔100 μL加入96孔酶标板;包被过夜后经PBST清洗,用50 g·L-1脱脂乳粉封闭2 h后PBST清洗5次;每孔加100 μL 1 000倍稀释的待检血清,37 ℃孵育 50 min;PBST清洗5次后每孔加100 μL 1 000倍稀释的二抗,37 ℃孵育1 h,PBST清洗5次后每孔加入100 μL TMB显色液,反应5 min后加入终止液终止反应,使用酶标仪检测A450值。

1.8 统计分析

2.1 重组表达载体的验证

重组表达载体结构如图1-A所示,随机选取通过无缝克隆重组后涂布于含氨苄抗性的LB平板上的单菌落,以PINU-F/R为引物进行菌落PCR,扩增的目的片段大小为1 856 bp,琼脂凝胶电泳结果如图1-B所示,选取条带单一且与理论值大小相符的8号泳道对应菌株送至金唯智公司测序,将测序正确菌株命名为pUKDN115-fiber-2。

图1 含fiber-2 基因表达载体的构建及PCR产物鉴定Fig.1 Construction of expression vector containing fiber-2 gene and PCR amplification identification A.载体pUKDN115-fiber-2示意图Schematic diagram of carrier pUKDN115-fiber-2;B.PCR扩增鉴定PCR product identification;1～8:fiber-2 gene;M. DNA marker DL2 000.

图2 含pUKDN115-fiber-2的马克斯克鲁维 酵母转化子菌落的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of Kluyveromyces marxianus transformants containing pUKDN115-fiber-2 1～8:fiber-2 gene;M. DNA marker DL2000.

2.2 重组酵母表达菌株的筛选

将测序正确的菌株通过化学转化TOP-1酵母并涂布SD-Ura平板,随机挑选转化子以PINU-F/R为鉴定引物,进行菌落PCR扩增以筛选出阳性菌株。琼脂凝胶电泳结果如图2所示,菌株6、7、8的条带大小与预期大小相符。

2.3 DAdV-3 Fiber-2蛋白的表达与检测

挑取验证正确菌株,接种于YD液体培养基中,培养3 d后用高压均质仪破碎菌液,离心后收集上清液进行SDS-PAGE、Western blot与琼脂凝胶扩散试验(AGP)。DAdV-3 Fiber-2蛋白相对分子量大小约为 55 000,在SDS-PAGE结果图中(图3-a),与空酵母菌比较,重组酵母在(50～70)×103处有1条明显的蛋白条带,且经Western blot检测(图3-b),该条带能被鸭腺病毒3型血清抗体识别,确定该目的条带为DAdV-3 Fiber-2蛋白;通过AGP检测目的蛋白效价为1∶16(图3-c)。

图3 DAdV-3 Fiber-2蛋白表达的验证Fig.3 Expression detection of DAdV-3 Fiber-2 protein a.SDS-PAGE检测重组菌表达产物;Detection of expression of recombinant bacteria by SDS-PAGE;b.DAdV-3 Fiber 2蛋白表达的Western blot检测Western blot was used to detect the expression of DAdV-3 Fiber-2 protein;c.Fiber-2蛋白效价的琼脂凝胶扩散检测Agarose gel diffusion(AGP)was used to detect Fiber-2 protein titers. M. 蛋白标准品Protein marker;1.含pUKDN115质粒的酵母菌裂解液Yeast lysate containing pUKDN115 plasmid;2.含pUKDN115-fiber-2的酵母菌裂解液Yeast lysate containing pUKDN115-fiber-2;3.含pUKDN115-fiber-2的酵母菌裂解液Yeast lysate containing pUKDN115-fiber-2;4.含pUKDN115质粒的酵母菌裂解液Yeast lysate containing pUKDN115 plasmid;A.鸭腺病毒3型抗体血清DAdV-3 antibody serum;B-G.1、2、4、8、16和32倍稀释的发酵液上清液1,2, 4, 8, 16,32 times diluted supernatant of fermentation broth.

图4 TOP-fiber-2重组菌的高密度发酵与检测Fig.4 High density fermentation and detection of TOP-fiber-2 recombinant strain a. 发酵过程中的补液量The amount of rehydration during fermentation;b. 发酵过程中菌体生长曲线Cell growth curve during fermentation;c. 发酵液镜检图;Microscopic examination of fermentation broth;d. SDS-PAGE 检测各发酵时间点蛋白表达量SDS-PAGE was used to detect the protein expression at each time point(1.含pUKDN115质粒的酵母裂解液Yeast lysate containing pUKDN115);e. SDS-PAGE 检测纯化后蛋白表达量SDS-PAGE was used to detect the expression level of purified protein(M.蛋白标准品Protein marker;2.含pUKDN115-fiber-2酵母裂解液Yeast lysate containing pUKDN115-fiber-2);f. 纯化蛋白效价的琼脂凝胶扩散检测AGP was used to detect the titer of purified protein(A.鸭腺病毒3型抗体血清 DadV-3 antibody serum;B—G.8、16、32、64、128和256倍稀释的发酵液上清8,16,32,64,128,256 times diluted supernatant of fermentation broth).

2.4 TOP-fiber-2重组株的高密度发酵、纯化工艺及效价检测结果

通过15 L生物反应器进行高密度发酵,发酵过程中不断补充补料液和氨水,补液量如图4-a所示。每隔6 h取样对菌体浓度及蛋白表达情况进行检测。试验结果如图4-b所示,菌体湿重和D600值在前 48 h 基本以指数增长,48 h后逐渐呈下降趋势。52 h停止发酵,取发酵液至显微镜下观察,如图4-c所示,细胞均呈梭形,两端钝圆,形态单一且一致,无杂菌污染。

将不同时间点的发酵菌液破壁并稀释3倍后进行SDS-PAGE验证,通过图4-d可观察到目的蛋白于6 h开始表达,表达量在48 h逐渐趋于平稳。通过BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后的总蛋白量,然后根据SDS-PAGE胶中蛋白条带灰度值估算目的蛋白占比,最终确定目的蛋白质量浓度约为453 μg·mL-1(图4-e),AGP检测蛋白纯化液效价为1∶128(图4-f)。

2.5 排毒量及抗体水平检测

根据试验方法1.7节中qPCR方法,建立病毒拷贝数标准曲线,根据标准曲线计算得出各试验组所采肛拭子中的病毒含量。结果如表2所示,免疫试验组中所测得的病毒含量极显著低于攻毒对照组(P<0.001),高剂量免疫组中病毒含量远低于低剂量免疫组,但两组间差异并不显著。

表2 荧光定量PCR(qPCR)检测肛拭子中病毒含量Table 2 Detection of virus content in anal swab by quantitative PCR(qPCR)

图5 免疫攻毒试验中血清抗体水平的ELISA检测Fig.5 Detection of serum antibody level in immune challenge test by ELISA**P<0.01.

通过ELISA测得各组番鸭血清抗体水平。如图5所示,免疫后第10天,疫苗免疫组的血清特异性抗体明显高于空白组;随后疫苗免疫组抗体水平持续升高,在第21天时血清特异性抗体要明显高于第10天时的抗体水平。高剂量疫苗组在免疫后第10天和第21天的特异性抗体水平均高于低剂量疫苗组且均极显著高于空白对照组(P<0.01)。

酵母表达系统具有繁殖快、易发酵、低成本、高表达、无内毒素等优点,可用于制备高效、低成本的动物疫苗。其中本试验使用的马克斯克鲁维酵母是一种安全的食用酵母,已经通过了欧盟食品安全监督局和美国食品和药物管理局(FDA)的安全认证,被国家卫健委批准为新食品原料[12-13]。该酵母生长旺盛,生物量大,生长周期短,生长温度范围广,蛋白表达量高。有研究表明,使用菊粉酶启动子的马克斯克鲁维酵母,在同样分泌表达α-半乳糖苷酶试验中,表达量是使用强启动子PGK或GAL7酿酒酵母的76倍[14-16],在工业化大规模生产中具有较大优势[17-19]。复旦大学利用该系统,成功表达了犬细小病毒VLP(virus-like particle)蛋白,其表达量可高达2 g·L-1,是已知报道的最高表达水平[14],说明该系统非常适合用于开发动物疫苗。

本研究利用马克斯克鲁维酵母表达系统成功表达了鸭腺病毒3型Fiber-2蛋白,蛋白表达量可达453 μg·mL-1,优于已有报道的大肠杆菌表达系统[11]。用该酵母表达的Fiber-2蛋白制备亚单位疫苗,经动物试验验证具有良好的免疫原性,对DAdV-3的感染具有一定预防作用。但通过荧光定量PCR检测发现,疫苗免疫的试验鸭也会排出少量的病毒,说明该亚单位疫苗虽然能在一定程度上预防DAdV-3的感染,但不能完全阻断排毒。

DAdV-3作为近年新发现的一株毒力强、流行性高的水禽类腺病毒,除了水平传播外也可垂直传播,且易与多种病毒混合感染鸭群,造成幼龄及成年鸭死亡。在2014年从广州地区开始发现并流行后,陆续在全国范围内,尤其在南方地区水禽中开始流行,对水禽养殖业造成了巨大的经济损失。然而,目前对鸭腺病毒3型相关疫苗的研究报道较少且无商品化疫苗,市场存在较大空缺。从本研究结果可知,DAdV-3fiber-2基因具有良好的免疫原性,通过表达量高且安全的马克斯克鲁维酵母为载体制备的含DAdV-3fiber-2基因的亚单位疫苗,对DAdV-3起到一定的预防作用,是开发针对新型DAdV-3的理想候选疫苗,具有一定的应用价值,为后续的产品研发奠定了基础。

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