KRAS,基因多态性与云南汉族人群非小细胞肺癌的相关性分析

梁 燕 ，王 磊 ，雷 鸣 ，陈本超 ，孙 萍 ，李 帅 ，刘 莉 ，王倩蓉 ，廖曼霖 ，马千里

（1）云南开放大学健康护理学院，云南 昆明 650500;2）昆明医科大学第三附属医院胸外科，云南 昆明 650118;3）昆明市儿童医院，云南 昆明 650228）

根据最新的全球癌症统计，2020 年约1 000万人死于癌症相关疾病。在中国，2020 年癌症死亡病例约300 万例，占全世界的30.2%[1]。在所有的癌症中，肺癌是男性癌症发病占比（14.3%）和癌症死亡占比（21.5%）最高的癌症。在女性中，肺癌是女性癌症发病占比（8.4%）及癌症死亡占比第一（13.7%）的癌症[1]。肺癌的发生是一个非常复杂的过程，是多种因素共同作用的结果。除吸烟，空气污染等被认为是肺癌发生的重要危险因素以外[2]，越来越多的研究发现，遗传因素同样发挥着重要作用[3]。

Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog，KRAS）基因是在人类癌症中发现的第一个致癌基因[4]，其为RAS家基因族的一员。研究认为，遗传变异是导致癌症发生的重要因素，而其中，由RAS 家族成员引起的突变最为常见，约27%的肿瘤发生与其密切相关[5]。Tomasini 等研究认为部分肿瘤的发生发展与KRAS 基因过表达或者突变导致的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路持续活化相关[6]。

单核苷酸多态性（single nueleotide polymorphism，SNP）定义为一个核苷酸插入、缺失或改变成为其他核苷酸。基因的SNP 可影响基因正常表达或蛋白质的变异，从而影响疾病的发生发展[7]。如同其他致癌基因一样，KRAS 基因中的SNP 也被发现与多种癌症的发生发展具有相关性[8]。chneiderova 等发现KRAS 基因中 rs712 基因型 TT的携带者通过影响与微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）的相互作用，从而导致 miRNA 表达差异而降低患直肠癌的易感性[9]。

本研究选取KRAS 基因中3′UTR 区域3 个SNP 位点（rs12587G >T、rs12245A >C、rs1137282A >G），研究其与非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的相关性。在此基础上，对病例组进行分层分析，进一步研究这3个SNP 位点与非小细胞肺癌病理类型以及临床分期的相关性。以期为非小细胞肺癌的的早期诊断以及治疗提供新的靶点及思路。

1.1 研究对象

本研究设置病例组和对照组。病例组：455例确诊为非小细胞肺癌的患者，病例确诊时间：2012 年3 月至2016 年2 月期间，病例确诊医院：昆明医科大学第三附属医院。病例排除要求参照实验室前期已经建立的排除标准[10]。病例组排除术前接受放化疗等抗肿瘤治疗的患者；
排除患有其他恶性肿瘤的患者。选取同期在同一医院体检的健康人群391 人作为对照组。所有参加者均为居住于云南地区彼此无血缘关系的汉族个体。研究方案经医院伦理委员会审查批准，所有样本采集均征得本人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 样品采集及基因组DNA 提取使用EDTA抗凝采血管，采集病例组和对照组空腹静脉血5 mL。样品基因组DNA 提取采用全血基因组DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国QIAGEN 公司），按照说明书操作。采用超微量紫外可见分光光度计（NanoDrop-2000，美国Thermo Fisher Scientific 公司）检测基因组DNA 的浓度和纯度。基因组DNA 置于2 ℃至8 ℃储存。

1.2.2 基因分型基因分型方法采用TaqMan 探针法。TaqMan 探针（TaqMan SNP Genotyping Assays）和SNP 分型试剂（TaqPath™ ProAmp™Master Mix）购买于美国Applied Biosystems 公司。SNP 位点rs12587 分析序列号为C－12104199_10、SNP 位点 rs12245 分析序列号为C－176064436_10、SNP 位点rs1137282 分析序列号为C－25471658_10。SNP 分型检测使用美国Applied Biosystems 公司QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量PCR 仪，具体检测过程及验证方法参照实验室已经建立的方法[11]。

1.3 统计学处理

本研究统计学分析采用SPSS（19.0）软件进行，采用t检验分析各组间的年龄差异，采用卡方（χ2）检验分析各组间的性别差异，采用哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）检验样品的代表性。并用χ2检验比较各组间SNP 位点等位基因和基因型频率的差异。采用SNPStats 软件（https://www.snpstats.net/start.htm）对 SNP 位点基因型进行遗传模式的分析，共分析五种遗传模式（共显性模式、显性模式、隐性模式、超显性模式和逻辑累加模式），同时计算赤池信息量准则（akaike information criterion，AIC）和贝叶斯信息准则（bayesian information criterions，BIC）的数值，并以此来确定最优的遗传模式（具有最小AIC、BIC 数值）。采用 SHEsis（http://analysis.biox.cn/myAnalysis.php）软件计算各Kras 基因中各SNP 位点间的连锁不平衡关系。根据连锁不平衡结果构建单倍型，采用χ2检验比较构建的单倍型在各组中分布频率的差异。统计学分析中，当P<0.05 认为差异具有统计学意义，当存在多重比较时，采用Bofferroni 校正，当校正后P<0.016（0.05/3）时，认为差异具有统计学意义。

2.1 研究对象基本特征

本研究病例临床特征分析见表1。病例组和对照组排除了性别和年龄差异（P>0.05）。病例组分为鳞癌164 例、腺癌265 例、鳞癌合并腺癌8 例，其他类型肺癌18 例。临床分期为I 期+II期148 例、III 期+IV 期307 例。

表1 病例的临床特征（n）Tab.1 The clinical characteristics of the subjects enrolled in this study（n）

2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验研究样本群体代表性

KRAS 基因rs12587、rs12245、rs1137282 位点基因型在对照组（P=0.130、0.846、0.485）的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡检验（P>0.05），说明本研究的样本为具有群体代表性的随机样本。

2.3 KRAS 基因SNP 位点与非小细胞肺癌（NSCLC）的相关性

rs12587（G >T）位点等位基因在NSCLC 组与对照组中分布频率的差异有统计学意义（P=0.008），其中G 等位基因可能是NSCLC 发生的风险因素（OR=1.365，95%CI：1.086～1.716）。rs12587位点基因型在NSCLC 组与对照组中分布频率的差异经Bofferroni 校正后无统计学意义（P=0.035）。rs12245、rs1137282 位点等位基因与基因型在NSCLC 组与对照组中分布频率的差异均无统计学意义（P>0.017），见表2。

表2 KRAS 基因SNP 位点等位基因和基因型在NSCLC 和对照组的分布频率[n（%）]Tab.2 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in KRAS gene between NSCLC case and control groups [n（%）]

2.4 KRAS 基因SNP 位点与NSCLC 相关性的遗传模式分析

rs12587 位点的最优遗传模式为逻辑累加模式，该结果表明，该位点2T/T+G/T 基因型与与NSCLC 的风险降低有关（OR=0.75，95%CI：0.60～0.94）见表3。rs12245 与rs1137282 位点与NSCLC 的发生无相关性（P>0.05），见表3。

表3 KRAS 基因3 个SNP 位点与NSCLC 相关性的遗传模式分析[n（%）]Tab.3 The inheritance analysis of three SNPs between NSCLC and control groups [n（%）]

2.5 KRAS 基因SNP 位点连锁不平衡分析及单倍型构建

KRAS 基因3 个SNP 位点连锁不平衡分析结果显示，3 个SNP 位点rs12587、rs12245、rs1137282存在连锁不平衡，D’值分别为0.993、0.932、0.938。单倍型结果显示，单倍型rs12587Grs12245T-rs1137282A 频率在NSCLC 组与对照组中的差异有统计学意义（P=0.041），但Bofferroni校正后则无统计学意义（P>0.05），见表4。其余单倍型频率在NSCLC 组与对照组的差异无统计学（P>0.05）。

表4 NSCLC 组和对照组的单倍型分布差异[n（%）]Tab.4 The haplotype analysis between CC and control group [n（%）]

2.6 KRAS 基因SNP 位点与NSCLC 病理类型的相关性

根据病理类型分层分析结果显示，鳞癌组与对照组的rs12587 位点等位基因和基因型频率差异有统计学意义（P<0.001、P=0.001），其中等位基因G 是鳞癌的风险因素（OR=0.55，95%CI0.39～0.77），见表5。鳞癌组与对照组的rs12245位点等位基因和基因型频率差异有统计学意义（P=0.003、P=0.001），等位基因G 是鳞癌发生的风险因素（OR=0.60，95%CI0.43～0.84），见表5。鳞癌组和对照组中rs1137282 位点等位基因及基因型频率差异无统计学意义（P>0.05），见表5。而在腺癌和对照组中，以上3 个位点等位基因及基因型频率均差异无统计学意义（P>0.05），见表5。

表5 KRAS 基因中SNP 位点的等位基因和基因型在鳞癌病例组、腺癌病例组和对照组的分布频率[n（%）]Tab.5 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in KRAS gene between SCC，AC and control groups [n（%）]

2.7 KRAS 基因SNP 位点与NSCLC 病理类型相关性的遗传模式分析

在鳞癌组与对照组的比较分析中，rs12587 位点的最优遗传模式为显性模式，携带G/T+T/T 基因型的个体患鳞癌的风险显著降低（P<0.001，OR=0.45，95%CI0.30～0.68），见表6。rs12245位点的最优遗传模式为超显性模式，携带A/T 基因型的个体患鳞癌的风险显著降低（P<0.001，OR=0.43，95%CI0.28～0.67），见表6。在不同遗传模式下，3 个SNP 位点与腺癌无相关性（P>0.05），见表6。

表6 SNP 位点在NSCLC 不同病理类型与对照组的遗传模式分析[n（%）]Tab.6 The inheritance analysis of the SNP sites between SCC，AC group and control group [n（%）]

2.8 KRAS 基因SNP 位点与NSCLC 临床分期的相关性

临床分期的分层分析结果显示，rs12587，rs12245，rs1137282 位点与NSCLC 的临床分期无相关性（P>0.05）。

引起癌症发生的病因和诱因众多，其中遗传因素所起的作用不容忽视。KRAS 基因编码的蛋白属于小的GTPase 膜结合蛋白的一种，在细胞中作为控制细胞活跃和不活跃状态的分子开关，KRAS 在其活跃状态下可激活许多不同的细胞内传导信号通路[5]，导致下游信号通路被过度活化，从而抑制恶性肿瘤细胞凋亡，刺激促进其生长[12−13]。

MiRNA 是一组非编码小RNA，其和基因3′UTR 区域的SNP 位点的相关性可能进一步影响到基因的表达[8，14−15]。已有研究证明癌症的发生与KRAS 基因3′UTR 区域的SNP 具有相关性[16]。例如，位于 KRAS 基因 3′ UTR 区域的与miRNA（let-7 miRNA）互补位点的SNP，与KRAS表达增加和let-7 miRNA 水平降低相关，并已被证明会增加非小细胞肺癌的风险[17]。

本研究发现，NSCLC 组与对照组中，KRAS基因的rs12587 位点等位基因频率具有显著差异，其中G 等位基因可能与NSCLC 的发生风险相关。同时，遗传模式分析显示，2T/T-G/T 基因型个体比G/G 基因型个体患NSCLC 的风险显著降低。2016 年，Dai 等[18]研究表明rs12587 位点与中国人群结直肠癌无关。随后，Lin 等[19]的研究表明rs12587 与中国儿童神经母细胞瘤不相关。但是，2019 年，Fu 等[20]的研究表明rs12587 位点GT 基因型增加了肾母细胞瘤的风险。造成研究结果差异的原因可能是，rs12587 位点在不同的肿瘤类型中发挥的作用不同，甚至是同一类型肿瘤的不同类型。如本研究就发现，rs12587 位点与NSCLC 鳞癌的发病风险相关，但与腺癌的发病风险无相关性。

本研究发现，rs12245 位点携带A/T 基因型的个体患鳞癌的风险显著降低。2014 年，Cipollini等[21]发现rs12245 与女性患卵巢癌易感性风险增加有相关性。2016 年，Dai 等[18]研究KRAS 基因上包含rs12245 位点在内的6 个SNP 位点，并未发现rs12245 与中国人群结直肠癌的生存及复发转移之间的相关性。2020 年，Liu 等[22]的研究表

明在非霍奇金淋巴瘤患者中rs12245 位点的TT 基因型增加了KRAS 基因表达量。综合以上研究，可以发现，rs122455 与不同类型癌症的风险相关性并不一致。而要进一步验证rs12245 位点与鳞癌的风险相关性，则需进一步扩大人群样本量。

本研究没有发现rs1137282 与NSCLC 的相关性。2017 年，Sullivan 等发现NSCLC 患者中，rs1137282 位点携带等位基因G（A/G+G/G）的患者3 a 无复发生存率是53%，基因型为A/A 的患者3 a 无复发生存率是76%，差异有统计学意义（P=0.02）。基于以上结果，Sullivan 等[23]认为rs1137282 可被视为可切除 NSCLC 患者复发的预后因素。2018 年，Riera 等[24]发现rs1137282 的GG 基因型与 II 期结肠癌患者的总生存期下降显著相关。2019 年，Shen 等[25]发现 KRAS 中的rs1137282 与甲状腺乳头状癌患者远处转移性疾病的低风险相关。以上研究结果提示，rs1137282 位点可能与癌症患者的复发、生存及转移相关，而关于它在癌症的发生发展中的相关性作用还需在更多疾病类型及更大人群样本中进一步验证。

值得注意的是，虽然本研究发现rs12587 位点与NSCLC 的发生具有相关性，但是单倍型分析结果却显示3 个位点构建的单倍型与NSCLC 的发生发展没有相关性。造成这一差异的原因可能是：1，本研究的病例数相对中等，但不足以获得有差异的统计结果，因此单倍型分析无相关性；
2，KRAS 基因对于个体非常重要，影响KRAS 基因3′UTR 稳定性的位点可能不止1 个位点，当rs12587 位点发生变异，KRAS 基因可通过其他位点抵消rs12587 位点变异对KRAS 基因的影响。

今后要充分研究KRAS 基因与非小细胞肺癌的相关性，在扩大样本量的同时，尚需结合更多SNP 位点进行系统性分析，同时辅以功能验证。

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