“冬病夏治”方中白芥子促进延胡索乙素经穴、非经穴部位皮肤渗透性比较研究

高远，李冀，周梦丹，韩东卫✉

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；

2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；
3.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550001）

皮肤作为人体最大的器官是药物经皮吸收的主要场所，具有给药面积大、血管分布丰富的优势［1-2］。但是，经皮给药往往难以得到有效的血药浓度，这是由于皮肤死亡细胞构成的角质层具有层状紧密结构，极大阻碍了药物通过皮肤，进入血液循环［3-4］。因此，降低角质层屏障作用、改善皮肤渗透性一直是经皮给药研究需要攻克的难点问题。研究发现［5-6］，穴位部位皮肤表皮角质层较非穴位部位更薄，结缔组织更加疏松，肥大细胞分布更加丰富，这种特殊的组织结构恰恰适合作为中药透皮吸收的通道。

“冬病夏治”方出自《张氏医通》，目前广泛用于临床，该方中白芥子、延胡索为君药，其中白芥子味辛性温，善走窜，是“内病外治”常用中药［7-8］。《本草经疏性》称白芥子：“味极辛，气温能搜剔内外”，可见其辛香走窜能力之强。体外透皮实验表明［9-12］，白芥子能够促进组方中盐酸麻黄碱、黄芩苷、细辛脂素等多种中药的有效成分透皮吸收，可以视其为一种特殊的中药透皮吸收促进剂。本文将白芥子强大的促透能力和穴位特殊的组织结构联系起来，提出白芥子穴位用药的治疗方案，从促进穴位吸收的角度开展研究，为探索穴位用药的作用机制提供新思路。

本研究以“冬病夏治”方中君药白芥子和延胡索作为“药对组合”，以延胡索有效成分——延胡索乙素为指标，通过经穴、非经穴两种途径于类风湿性关节炎模型家兔皮肤给药，考察有、无白芥子配伍以及经穴、非经穴这两种途径下，白芥子对延胡索乙素皮肤渗透的促进作用，旨在寻找到一种具有更优皮肤渗透性的外用给药方案。

1.1 动物

新西兰家兔48只，雌雄各半，体质量1.5～2.0 kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，生产许可证：SCX黑2022005，饲养环境温度20～25 ℃、湿度（45 ±5）%、12 h光照，饲养1周后进行造模，取材前禁食24 h。

1.2 仪器

Franz透皮扩散仪（天津市正通科技有限公司）；
高效液相色谱仪（Waters 中国），配置QSM－FIN－TUV色谱工作站。

1.3 试药

白芥子购自北京同仁堂股份有限公司，自制为白芥子粉，现用现粉碎；
延胡索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111902－202203）；
甲醇为色谱醇（美国Dikma公司）；
弗式完全佐剂（F5881－10 mL，美国Sigma公司）；
卵蛋白（A5253，美国Sigma公司）。

2.1 模型建立与分组

家兔背部取5个点，每个点皮下注射0.2 mL弗氏完全佐剂，作为首次致敏；
第14天相同位置再次注射弗氏完全佐剂，加强致敏；
第2次致敏第6天，双膝关节腔内注射卵蛋白0.4 mL（浓度为10.0 mg/mL），作为诱发剂；
3 d后膝关节肿胀达到最高峰，完成建模。

比较加入白芥子、不加白芥子体外释放分组：将模型家兔随机分为空白组（不加白芥子）、非经穴白芥子低剂量组（“冬病夏治”处方0.5倍量）、非经穴白芥子中剂量组（“冬病夏治”处方量）和非经穴白芥子高剂量组（“冬病夏治”处方2倍量）。

比较经穴、非经穴途径体外释放分组：将模型家兔随机分为非经穴组（“冬病夏治”处方量）、“足三里”白芥子低剂量组（0.5倍处方量白芥子）、“足三里”白芥子中剂量组（处方量白芥子）和“足三里”白芥子高剂量组（2倍处方量白芥子）。

2.2 延胡索乙素分析方法的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS（2.1 mm × 75 mm，1.8 μm）；
流动相：甲醇－0.1%甲酸水（62∶38三乙醇胺调节至pH值为6）；
流速：0.3 mL/min；
检测波长：280 nm；
进样体积：2 μL；
柱温：30 ℃。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取延胡索乙素对照2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀后得到0.1 mg/mL对照品储存液，4 ℃条件下保存备用。

2.2.3 样品溶液的制备

样品液过0.22 μm微孔滤膜，-20 ℃冰箱保存。精密取扩散池续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件进行UPLC检测。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.2”项下储备液，乙醇定容，制备成0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.1 mg/mL系列对照品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件进行检测，以药物峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.5 专属性试验

按“2.2.2”项下方法制备空白溶液，甲醇定容，微孔滤膜过滤，按“2.2.1”项下色谱条件进行UPLC检测。

2.2.6 精密度试验

精密称取0.001、0.004、0.1 mg/mL对照品溶液，平行进样6次，按“2.2.1”项下色谱条件进行UPLC检测。

2.2.7 加样回收率试验

精密称取“2.2.2”项下延胡索乙素对照品溶液，加入不含药的透皮接收液，5 mL容量瓶定容，配制成0.001、0.004、0.1 mg/mL溶液，每个质量浓度3份。

2.3 体外透皮实验

2.3.1 穴位定位

穴位部位选取家兔膝关节“足三里”穴位（位于后肢外侧，胫骨粗隆下约0.3 cm处）。非经穴部位选择胫骨边缘外侧，足三里旁开1～2 cm处（注意避开经络线）。

2.3.2 离体皮肤处理

剪掉模型家兔膝关节部位较长的兔毛，脱毛膏除去绒毛，再将家兔处死。按照“2.3.1”项下定位取“足三里”穴位处、足三里旁开处（非穴位区），得到面积约1.5 cm2的圆形皮肤，刀片刮掉皮下脂肪组织，生理盐水清洗后，4 ℃下保存备用。

2.3.3 离体透皮试验

将处理好的皮肤固定于Franz透皮扩散仪，设置恒温水浴温度36.8 ℃，磁力搅拌转速200 r/min。接收室内放入转子，注入5 mL生理盐水（使用前超声脱气）。平衡实验条件0.5 h之后，按照“2.1”项下分别将白芥子－延胡索乙素糊状物均匀涂于离体皮肤，置于扩散室和接收室之间，保持角质层一侧向上，接口面积为0.636 cm2，接收室体积5 mL。于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h分别取样1.0 mL，同时补充相同体积的生理盐水。按照“2.2.1”项下色谱条件测定延胡索乙素含量，利用累计释放公式计算单位面积累积透过量和百分比。

其中，Q（mg/cm2）为累积透过量，Cn和Ci分别代表为第n时间点、i个取样点测得的质量浓度（mg/mL），A为渗透面积（cm2），M为理论含药量。

稳态渗透速率为Q/h，该时间为累积透过量－时间曲线图的直线部分的斜率，本实验平均5～6 h区间内。以累积渗透率（Q%）为纵坐标，以时间（t）为横坐标得到透皮吸收曲线；
进行线性回归，得到体外渗透参数和释放曲线。

2.4 统计学方法

应用SPSS20.0统计软件进行分析，多组间采用单因素方差分析，配对t检验两组间差异（置信区间95%），相关系数显示该条件下适合进行配对t检验比较显著性。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

3.1 模型建立与分组结果

按照“2.1”项下方法造模，3 d后关节肿胀度为正常状态下2倍左右，且出现体温上升，饮食下降、活动减少的状态，表明造模成功。

3.2 延胡索乙素分析结果

按照“2.2”项下方法，建立分析方法，回归方程为Y= 9 567.4X－5 422.4（R= 0.999 87）。色谱峰型良好，出峰位置无干扰，专属性良好；
精密度试验测得RSD分别为1.97%、1.52%、0.99%，表明仪器精密度良好；
加样回收率试验测得平均加样回收率为98.49%，RSD为1.22%。

3.3 体外透皮实验结果

白芥子配伍下，累积透过量、稳态渗透速率均优于缺少白芥子的组别。随着白芥子用量增加，累积透过量、稳态渗透速率均有提高，且高剂量组 ＞ 中剂量组 ＞ 低剂量组。见表1。“足三里”经穴给药的条件下累积透过量、稳态渗透速率均优于非经穴给药。随着白芥子用量增加，累积透过量、稳态渗透速率均有提高，且高剂量组 ＞ 中剂量组 ＞ 低剂量组。见表2。白芥子配伍的条件下，12 h内累积渗透率显著优于缺少白芥子的组别。随着白芥子用量增加，累积渗透率显著提高。见图1。“足三里”经穴给药的条件，12 h内累积渗透率显著优于非经穴给药。随着白芥子用量增加，累积渗透率显著提高。见图2。

图1 白芥子促延胡索乙素累积渗透率曲线图

图2 白芥子促延胡索乙素经穴、非经穴累积渗透率曲线图

表1 各组延胡索体乙素体外渗透参数表（ ± s，n = 6）

表1 各组延胡索体乙素体外渗透参数表（ ± s，n = 6）

组别空白组（不加白芥子）非经穴白芥子低剂量组非经穴白芥子中剂量组非经穴白芥子高剂量组回归方程Y = 0.022 2X + 0.004 7 Y = 0.029 1X + 0.036 8 Y = 0.040 7X + 0.048 2 Y = 0.052 8X + 0.054 6稳态渗透速率［mg/（cm2·h）］0.320 0.467 0.643 0.782相关系数R2 = 0.990 6 R2 = 0.968 5 R2 = 0.951 7 R2 = 0.962 6累积透过量（mg/cm2）2.02 ± 0.30 2.96 ± 0.31 3.70 ± 0.35 4.94 ± 0.40

表2 各组延胡索乙素经穴、非经穴体外渗透参数表（ ± s，n = 6）

表2 各组延胡索乙素经穴、非经穴体外渗透参数表（ ± s，n = 6）

组别非经穴组“足三里”白芥子低剂量组“足三里”白芥子中剂量组“足三里”白芥子高剂量组回归方程Y = 0.040 7X + 0.048 2 Y = 0.051 5X + 0.080 2 Y = 0.064 4X + 0.112 1 Y = 0.078 3X + 0.103 1相关系数R2 = 0.951 7 R2 = 0.943 7 R2 = 0.921 7 R2 = 0.933 4累积透过量（mg/cm2）3.70 ± 0.35 5.01 ± 0.37 6.20 ± 0.41 7.49 ± 0.49稳态渗透速率［mg/（cm2·h）］0.643 0.905 1.128 1.435

3.4 统计学分析结果

白芥子高、中、低三组累积透过量均显著高于不加白芥子的空白组（P＜ 0.01），促渗透倍数随白芥子剂量提高而增加，即高剂量组 ＞ 中剂量组 ＞ 低剂量组。见表3。经穴给药的白芥子高、中、低三组累积透过量均显著高于非经穴组（P＜ 0.01），促渗透倍数随白芥子剂量提高而增加，即高剂量组 ＞ 中剂量组 ＞ 低剂量组，表现出渗透性对白芥子用量的依赖性。见表4。

表3 白芥子促延胡索乙素渗透配对t检验

表4 白芥子促延胡索乙素渗透经穴、非经穴配对t检验

一直以来，透皮吸收量少、血药浓度低、累积释放量达不到有效浓度是制约中药经皮制剂发展的难题。因此，无论是制备微乳、柔性脂质体等被动促进渗透方法，还是微针和离子导入，其最终目的都是降低角质层屏障作用，提高药物进入血液循环的量。而人体穴位部位恰恰具有角质层较薄、循经低电阻的特点，是药物经皮渗透的特殊通道。本文中非经穴（处方量）组与空白组给药方式、剂量是相同的，但不在同一批次，分别作为给药部位、给药剂量研究的对照，因此文中分为两组。

祝总骧等［13］在100名受试者的经络上进行皮肤阻抗测试，发现经络上所有穴位均有角质层薄、低电阻的特性。这是因为在穴位部位，由死亡细胞组成的角质层更薄，导电性更强，具有低电阻特性。安贺军［14］利用体表电阻检测法对穴位处电阻进行检测，结果发现，不同穴位间存电阻在差异，但是均低于非穴位部位，其中“足三里”和非穴位平均阻抗分别为（11.61 ± 2.09）（19.83 ± 2.39） Ω/m2，明显存在差异，可见二者角质层厚度差异显著。本文发现延胡索乙素“足三里”累积释放量显著高于非经穴，与上述研究结论一致，表明穴位作为给药部位更有利于有效成分透皮吸收。

以往透皮渗透研究中，往往将中药方剂中的单味药作为研究重点，忽视了药物配伍的相互作用。越来越多的研究［15-17］表明，古代经验方中的一些药物不但有药理作用，同时能够起到透皮吸收促进剂的作用，能够促进方中其他药物透皮吸收，特别是具有大量挥发性成分的中药，其促进透皮效果尤为显著，起到药物和辅料（透皮促进剂）的“双重”作用，实现了“药辅合一”。本文将“冬病夏治”方中君药白芥子、延胡索组成“药对”，发现胡索乙素累积透过量、稳态渗透速率、累积渗透率3种渗透参数均随着白芥子用量提高而增加，具有剂量依赖性，结合穴位给药和白芥子透皮促进的“双重”作用，得到了一种更好的中药外用给药方案。穴位部位的形态结构、生物物理特性具有明显特异性［18-20］，中药的经穴吸收过程与非经穴吸收也必然存在差异。但是，药物透皮吸收后，在体内分布、转运、排泄的路径是否也存在特异性，药物与穴位间是否有相互作用，还需进一步研究。

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