脊髓N-myc下游调节基因2对奥沙利铂诱导神经病理性疼痛及星形胶质细胞分化影响

崔立颖， 唐 君， 程 浩， 嵇 晴

南京大学医学院附属金陵医院 麻醉科，江苏 南京 210000

奥沙利铂是第三代铂类化疗药，被广泛用于治疗结直肠癌，其抗肿瘤作用较强，但神经毒性显著，长期应用该药诱发的严重神经病理性疼痛，发病率高达60%[1-2]。奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛(Oxaliplatin induced neuropathic pain，OINP)主要表现为明显的机械痛觉过敏、热痛觉过敏和冷痛觉过敏[3]。目前，对于OINP的治疗效果不佳，极大影响患者的生活质量。因此，积极探索OINP发生的分子机制，寻求其治疗靶点，仍然是目前的研究重点[4]。近年来，有研究报道，参与神经炎症的神经胶质细胞是造成慢性疼痛难以治愈的关键因素[5]。星形胶质细胞是中枢神经系统内表达较丰富的神经胶质细胞，当机体受到伤害性刺激后，星形胶质细胞被激活并可以活化为神经毒性A1表型星形胶质细胞和神经保护A2表型星形胶质细胞两种形态[6]。OINP模型大鼠中星形胶质细胞活化，而小胶质细胞未见活化，因此，进一步阐明星形胶质细胞在OINP中的具体作用对于其治疗意义重大[7]。N-myc下游调节基因2(N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2)是特异性表达于星形胶质细胞的一种早期应激反应基团[8-9]。笔者研究曾发现，NDRG2与慢性神经病理性疼痛的发生机制密切相关，在脊神经结扎诱导的慢性疼痛过程中，NDRG2表达显著增高并调节星形胶质细胞的反应增生[10]。本研究旨在探讨星形胶质细胞NDRG2是否参与OINP，并探讨其对脊髓星形胶质细胞表型分化的影响。现报道如下。

1.1 实验动物 选取清洁级(SPF级)雄性SD大鼠32只，周龄6～7周，体质量180～220 g，购于南京卡莱斯生物科技有限公司，饲养于南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)实验动物中心。所有的实验操作方案均通过南京大学医学院动物伦理委员会审核，且符合国际疼痛研究协会关于动物实验伦理的相关规定。

1.2 实验分组 实验分为两部分。第一部分：将16只雄性大鼠随机分为两组：Vehicle组(n=8)，0～4 d腹腔注射5%葡萄糖溶液；
Oxaliplatin组(n=8)，用5%葡萄糖注射液将奥沙利铂(MCE公司，南京)配置成2 mg/ml的溶液，0～4 d连续5 d腹腔注射奥沙利铂溶液，构建OINP模型[11]。第二部分：将16只雄性大鼠随机分为两组，两组均采用上述方法构建OINP模型，对照腺病毒+OINP组(AD-control+OINP组，n=8)，奥沙利铂腹腔注射前3 d鞘内注射2×108PFU AD-control；
Ndrg2干扰腺病毒(AD-Ndrg2-RNAi)+OINP组(AD-Ndrg2-RNAi+OINP组，n=8)，奥沙利铂腹腔注射前3 d鞘内注射2×108PFU AD-Ndrg2-RNAi。鞘内注射具体方法：麻醉大鼠后，以L5-6为中点，紧贴脊柱两侧纵行切开1.5 cm，去除L5-6棘突之间软组织，充分显露骨性结构，将PE10导管向头端置入椎管内，置入导管深度为2.0 cm，建立皮下隧道，将导管外端固定于颈部，热熔封口[12]。利多卡因验证位置后，注射病毒。

1.3 行为学测定 第一部分实验分别在给药0、7、11、18、25 d测定机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。第二部分实验分别在给药0、11 d测定MWT和TWL。MWT具体测定方法：将大鼠置于金属铁丝网高架上，适应15～30 min后，选用8根von frey纤维丝，将纤维丝垂直刺入大鼠足部中部，持续8 s，采用Up-down法计算MWT[13]。TWL具体测定方法：将大鼠置于有机玻璃上，辐射大鼠后爪足部中央，记录开始辐射至出现缩足反应的时间为TWL[14]。

1.4 蛋白免疫印迹 取各组大鼠脊髓腰膨大，使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸变性，SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜上，5%牛奶封闭1 h，一抗NDRG2(abcam，ab174850)、GFAP(CST，3670s)、C3(R&D，AF2655)、S100A10(Proteintech，11250-1-AP)、β-actin(Proteintech，66009-1-Ig)4℃孵育过夜，二抗(购自Proteintech)室温孵育1 h，ECL发光成像。使用Image J对条带进行半定量分析。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应 取各组大鼠脊髓腰膨大，使用TRIzol提取组织RNA，将RNA逆转录为cDNA，配置定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)体系，并在7500 Real Time PCR仪器进行检测，以Gapdh作为内参对照，用2-ΔΔCT进行相对定量。引物序列如下：Gapdh上游5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′，下游5′-GTTCACACCGACCTTC--ACC-3′；
Ndrg2上游5-′GAATTCTA-TGGCAGAGCTTCAGGAGGT-3′，下游5′-GGATCCTCAACAGGAGACTTCCATGGT-3′；
C3上游5′-CACAGCGGCACATTTCAT-3′，下游5′-GGGGTCGGTCAAGGTCTA-3′；
S1000a10上游5′-GAAAGGGAGTTCCCTGGGTT-3′，下游5′-CCCACTTTTCCATCTCGGCA-3′。

1.6 免疫荧光 分离脊髓腰膨大，4%多聚甲醛溶液固定4 h，再脱水、OCT包埋、冰冻切片机切取25 μm脊髓切片，5%驴血清封闭1 h，一抗(GFAP、NDRG2及C3)4℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育1 h，封片。荧光显微镜观察结果。

2.1 奥沙利铂腹腔注射后MWT及TWL的变化 雄性SD大鼠连续5 d腹腔注射奥沙利铂，成功构建OINP模型。造模前，Vehicle组与Oxaliplatin组的MWT和TWL比较，差异无统计学意义(P>0.05)。腹腔注射奥沙利铂7、11、18、25 d，Vehicle组的MWT、TWL均高于Oxaliplatin组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 OINP大鼠MWT、TWL变化情况

2.2 OINP大鼠脊髓星形胶质细胞激活及A1、A2表型星形胶质细胞分化改变 Oxaliplatin组脊髓星形胶质细胞标记物GFAP蛋白含量、A1表型星形胶质细胞标记物C3蛋白含量均高于Vehicle组，而A2表型星形胶质细胞标记物S100A10蛋白含量低于Vehicle组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。免疫荧光显示，与Vehicle组比较，Oxaliplatin组GFAP及C3荧光强度增加。见图3。

图2 OINP大鼠脊髓星形胶质细胞标志物GFAP、A1型星形胶质细胞标志物C3和A2型星形胶质细胞标志物S100A10的表达改变 图3 OINP大鼠脊髓背角GFAP及C3荧光表达(比例尺：50 μm)

2.3 大鼠脊髓NDRG2表达改变 Oxaliplatin组脊髓NDRG2蛋白含量显著高于Vehicle组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。免疫荧光显示，与Vehicle组比较，Oxaliplatin组NDRG2荧光强度增加。见图5。

图4 OINP大鼠脊髓NDRG2的表达改变 图5 OINP大鼠脊髓背角GFAP及NDRG2荧光表达(比例尺：50 μm)

2.4Ndrg2干扰对脊髓NDRG2蛋白含量及mRNA含量的影响 AD-Ndrg2-RNAi+OINP组NDRG2蛋白含量及Ndrg2相对mRNA含量显著低于AD-control+OINP组，差异有统计学意义(P<0.05)见图6。

图6 Ndrg2干扰后脊髓NDRG2蛋白及mRNA含量表达改变

2.5Ndrg2干扰对OINP大鼠疼痛行为学的影响 给药11 d，AD-Ndrg2-RNAi+OINP组的MWT和TWL显著高于AD-control+OINP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图7。

图7 脊髓Ndrg2干扰后OINP大鼠MWT和TWL的变化情况

2.6Ndrg2干扰对脊髓A1、A2表型星形胶质细胞分化的影响 AD-Ndrg2-RNAi+OINP组A1表型星形胶质细胞标志物C3的蛋白含量及mRNA含量低于AD-control+OINP组，而A2表型星形胶质细胞标志物S100A10的蛋白含量及mRNA含量显著高于AD-control+OINP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图8。

图8 脊髓Ndrg2干扰后OINP大鼠C3和S100A10蛋白及mRNA表达改变

奥沙利铂属于铂类化合物，通过与细胞DNA结合并交联发挥化学治疗作用，目前，临床上被广泛用于治疗肺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌等。奥沙利铂对神经元有显著毒性，除了病理性疼痛，还可引起癫痫发作、脑水肿、中风和视觉损伤[15]。奥沙利铂诱导的周围神经病变在停药后不可逆转，甚至其神经损伤可能加重[16]。本研究通过腹腔注射奥沙利铂溶液构建了OINP模型，在不同时间点分别检测了奥沙利铂腹腔注射后的机械痛觉敏感性和热痛觉敏感性，大鼠MWT和TWL出现了显著而持久的下降，验证了奥沙利铂引起了典型的神经病理性疼痛。

在外周神经损伤后，反应性星形胶质细胞可以分化为神经毒性A1表型和神经保护性A2表型[17]。神经毒性A1型星形胶质细胞失去促进神经元存活、生长、突触发生和吞噬作用的能力，并诱导神经元和少突胶质细胞死亡。A1星型胶质细胞高度存在于人类神经退行性疾病中，包括阿尔兹海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化和多发性硬化症等[18-20]。近年来，有研究报道，在慢性手术后疼痛中，星形胶质细胞向A1表型分化，而恢复A1/A2比例可以缓解皮肤肌肉损伤引起的机械性疼痛[21]。本研究结果发现，在OINP模型中，大鼠脊髓星形胶质细胞发生激活，GFAP和C3蛋白表达显著增加，伴随S100A10蛋白表达显著降低，同时，大鼠的疼痛行为学发生改变，表明奥沙利铂腹腔注射诱导脊髓星形胶质细胞增生活化，并诱导向A1表型分化，提示神经毒性A1表型星形胶质细胞参与OINP的发生发展过程。

NDRG2广泛分布于中枢神经系统内，并且特异性表达于星形胶质细胞内，参与调节星形胶质细胞反应性增生，在阿尔兹海默病、缺血再灌注损伤、实验性自身免疫性脑脊髓炎等多种神经系统疾病中发挥重要作用[22-24]。笔者前期研究发现，NDRG2在脊神经结扎诱导的神经病理性疼痛的发生和发展过程中发挥了重要的调控作用[10]。在本研究中，鞘内注射病毒干扰脊髓Ndrg2表达能够导致雄性OINP大鼠的MWT及TWL显著增加，显著缓解奥沙利铂诱导的机械痛和热痛。同时，本研究还发现，干扰脊髓Ndrg2，可以显著抑制A1表型星形胶质细胞分化，增加A2表型星形胶质细胞表达。这表明，NDRG2参与调节了星形胶质细胞的极化，提示NDRG2可能通过调节反应性星形胶质细胞的表型分化，从而促进OINP的发生发展。

综上所述，脊髓背角NDRG2促进星形胶质细胞向神经毒性A1表型分化，从而促进OINP雄性大鼠产生机械痛觉过敏和热痛觉过敏，为治疗OINP提供潜在的干预靶点。

猜你喜欢星形奥沙利胶质星形诺卡菌肺部感染1例并文献复习传染病信息(2022年2期)2022-07-15人类星形胶质细胞和NG2胶质细胞的特性神经损伤与功能重建(2020年11期)2020-12-01小胶质细胞——阿尔茨海默病中重新回炉的热点广东医科大学学报(2020年6期)2020-02-06带有未知内部扰动的星形Euler-Bernoulli梁网络的指数跟踪控制数学物理学报(2019年3期)2019-07-23视网膜小胶质细胞的研究进展湖南中医药大学学报(2016年1期)2016-12-01耐奥沙利铂人胃癌SGC-7901细胞具有高侵袭转移性及上皮间质转化特征中国组织化学与细胞化学杂志(2016年4期)2016-02-27雷替曲塞联合奥沙利铂治疗晚期结直肠癌患者的疗效观察西南军医(2016年2期)2016-01-23侧脑室内罕见胶质肉瘤一例磁共振成像(2015年1期)2015-12-23奥沙利铂联合羟基喜树碱治疗晚期胃癌临床分析中国卫生标准管理(2015年15期)2015-01-26一类强α次殆星形映照的增长和掩盖定理东北师大学报（自然科学版）(2014年1期)2014-02-27