页岩气田含氧管道内硫酸盐还原菌生长特性

覃 敏， 廖柯熹， 白 杨， 廖呈龙， 韦孟佼

(1. 西南石油大学石油与天然气工程学院油气储运研究所， 四川 成都 610500；
2. 中国石油西南油气田公司， 四川 成都 610051；

3. 中国石油西南油气田输气管理处， 四川 成都 610213)

硫酸盐还原菌(SRB)是一类可以通过异化作用将硫酸盐还原为硫离子的原核微生物[1]，并且SRB 种类较多，据统计，已发现18 个属40 多种SRB。

他们不仅形态差距大，有杆状、球状、卵状、柠檬形等；
并且代谢性能也具有差异，主要体现在异养和自养以及对溶解氧的耐受程度不同。

此外，学者在海洋、土壤、污水等缺氧的环境中发现了SRB，因此常认为SRB 属于严格厌氧生物[2]。

但随着对SRB 认识的不断深入，学者发现部分种群的SRB 趋向于微需氧[3]。

SRB 广泛存在于石油与天然气输送系统中，带来腐蚀、环境污染等危害[4]。

SRB 能利用金属表面的有机物作为碳源，并利用氢将硫酸盐还原为硫化氢，引起腐蚀原电池的阴极去极化反应[5]。

由于SRB 特殊的代谢过程，其对碳钢、不锈钢、合金均能造成严重腐蚀，威胁油气田安全生产[6，7]。

国内某页岩气管线1 a 内连续发生7 次集气管线腐蚀穿孔，经过腐蚀产物分析，存在明显的SRB 腐蚀特征[8，9]。

南川页岩气田油管在SRB 和CO2的共同作用下发生腐蚀断裂[10]。

我国西南某页岩气井区井下管柱在浅井段出现SRB 腐蚀并导致了穿孔[11]。

因此，明确页岩气集气系统内硫酸盐还原菌的类别以及代谢特征对页岩气集气系统的安全生产以及生物腐蚀控制具有重要意义。

本工作通过对页岩气管线水质进行测试发现，页岩气管线中存在大量的SRB。

为此，通过富集纯化后，采用Illumina 高通量测序技术对SRB 种群进行分析，并测试了SRB 在不同溶解氧含量环境中的生长代谢活性，为页岩气含氧集气管线SRB 腐蚀的防护提供了参考。

1.1 样品采集

在页岩气井口平台分离器出口采集页岩气集气管线水样。

采集到的水样装于无菌密封袋中，并保存在4℃环境中。

1.2 水质理化参数测定

采用ICS-5000 多功能离子色谱仪测定水样的离子成分。

采用PHS-3C 雷磁pH 计测量水样的pH 值。

采用JPB-607A 雷磁溶解氧测定仪对水样的溶解氧浓度进行测试。

根据SY/T 0532“油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法”，采用绝迹稀释法(MPN)测量水样中的硫酸盐还原菌浓度。

1.3 硫酸盐还原菌的分离

采用API corrected Postgate’s C 培养基富集SRB。培养基组成如下:1.000 g/L 酵母粉、4.500 g/L Na2SO4、1.000 g/L NH4Cl、0.060 g/L CaCl2·2H2O、0.500 g/L K2HPO4、0.060 g/L MgSO4·7H2O， 6.000 g/L 乳酸钠，0.004 g/L FeSO4·7H2O 和0.300 g/L 柠檬酸钠，培养基溶液总体积为1 L，然后用NaOH 调节pH 值至7.2[12]。

然后在高温高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。1 L培养基中注入1 mL 现场水样，富集7 d。

将上述培养基煮沸后，通入N2除氧，加入2%(摩尔分数)的琼脂，待温度降低后，采用富集菌液均匀涂布在平板上，盖上皿盖，并装入厌氧安宁包，放入37 ℃的恒温箱中培养7 d 出现黑色菌落。

将黑色菌落接入API corrected Postgate’s C 培养基中，培养7 d。

重复多次得到纯化的SRB。

1.4 DNA 提取与PCR 扩增

取纯化后的SRB 菌液10 mL，放入100 mL 离心管中，10 000 r/min 离心10 min，去除上清液，得到黑色沉淀，并在-80 ℃环境下储存。

在测试前，将得到的黑色沉淀在冰上融化并混合均匀后离心，得到菌液的DNA 粗提液。

采用Nano-Drop2000 分光光度计测试样品的DNA 纯度和浓度，DNA 纯度和浓度若满足要求则进行下一步实验。

基于1%(摩尔分数)的琼脂糖凝胶，实验20 min，电场强度为5 V/cm，采用琼脂凝胶电泳对菌液DNA 的完整性进行检测[13]。

基于Illumina 高通量测序技术，采用的3 组引物相关信息见表1。

以基因组DNA 为模板，对硫酸盐还原菌的2 种基因(dsrB、soxB) 进行扩增。

基因扩增(PCR)反应温度条件为: 98 ℃/5 min，98 ℃/30 s，55℃/40 s，72 ℃/1 min，32 个循环，72 ℃/7 min[3，14]。

表1 Illumina 高通量测序引物信息Table 1 Illumina high-throughput sequencing primer information

采用VecScreen(Screen for Vector Contamination，一种用于嵌合体检测软件)在线检测工具检测嵌合体，采用Mothur 软件(一种可用于生物信息学中的微生物生态群落分析的软件)将大于或等于90%的有效序列按照相似性归类到统一的OTU(Operational Taxonomic Unit，操作分类单元)。

1.5 溶解氧与SRB 生长特征测试

实验溶液选择API corrected Postgate’s C 培养基250 mL，注入1 mL SRB 富集溶液。

在三口烧杯中，放入溶解氧电极，如图1 所示。

按比例通入CO2、O2，控制瓶内溶解氧的含量。

设计溶解氧的浓度梯度分别为0，2.5，4.5，6.5 mg/L。

每隔1 d 通过取样口取样，测定溶液的pH 值并对SRB 计数。

图1 SRB 在不同溶解氧条件下的生长特征测试装置Fig. 1 Test device for growth characteristic of SRB under different dissolved oxygen conditions

2.1 水质理化参数

分离器液相出口水质矿化度高达36 993 mg/L，pH值为6.55，偏酸性，富含K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、CO32-、Cl-、SO42-，其中Cl-含量为21 913 mg/L，SO42-含量为179 mg/L。

采用MPN 计数法对SRB 进行计数，结果发现，页岩气集气管内水样中SRB 浓度为1.1×105个/mL。

取3 组水样进行溶解氧测试，水中的溶解氧为3.18 mg/L。

2.2 页岩气集气管道内SRB 种群分析

页岩气集气管道内SRB 样品经过纯化后，样品纯度和浓度测试结果为:DNA 溶液OD260/280 的值为2.33，样品浓度为8.31 μg/μL，表明提取的DNA 纯度较高。

样品Ladder 图如图2 所示，提取的DNA 主要为长度10 000 bp 左右的DNA 片段，条带较亮且无其他长度条带，可进行后续实验。

图2 样品Ladder 图Fig. 2 Ladder diagram of sample

图3 为吸附在页岩气集气管道中的SRB 的形态，可见SRB 主要呈杆状，吸附在管道内壁，并在管壁上形成了一层生物腐蚀产物膜。

图3 吸附在页岩气集气管道中的SRB 的形态Fig. 3 Morphology of SRB adsorbed in shale gas gathering pipeline

通过高通量测序后发现，从门水平上，页岩气中存在的SRB 主要可以分为3 类，分别是Bacteroidota、Firmicutes 和Desulfobacterota。

其中Bacteroidota 的丰度最高，为53.62%，Firmicutes 的丰度次之，为39.4%，Desulfobacterota 的丰度较小，占有7.02%。

以上种群的硫酸盐还原菌均会产生H2S。

页岩气SRB 在OTU 水平上的群落分析如图4 所示，页岩气SRB 存在6 个OTUs。

其中OTU1 和OTU3含量最大，OTU5 和OTU4 次之，OTU2 和OTU6 含量最小。

Bacteroidota 含有OTU1 和OTU3。

Firmicutes 含有3 个OTUs，分别是OTU4、OTU5 和OTU6。

Desulfobacterota 只含有OTU2。

图4 页岩气SRB 在OTU 水平上的群落分析Fig. 4 Community analysis of shale gas SRB at OTU level

2.3 不同浓度溶解氧作用下SRB 的生长特征

SRB 代谢过程中，消耗ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)和H+，在ATP 硫酰化酶作用下，激活硫酸根，产生APS(腺苷磷酰硫酸)和PPi(焦磷酸)。

PPi 会被水解为Pi(磷酸)。

而为了推动硫酸根离子活化反应向正反应方向进行，APS 必须通过APS 还原酶进行还原，生成亚硫酸盐和AMP(腺嘌呤核糖核苷酸)。

亚硫酸进一步消耗H+还原为H2S 和水。

在SRB 代谢活动中，每消耗10 mol H+会产生1mol H2S。

因此SRB 代谢越旺盛，溶液的pH 值就会升高得越快[9，15]。

硫酸根活化:

总反应:

APS 还原:

亚硫酸盐还原:

取富集与纯化SRB 进行实验。

在不同浓度溶解氧条件下，4 组SRB 溶液的pH 值随试验时间的变化如图5 所示，15 d 内，溶液的pH 值与初始pH 值相比整体处于上升趋势。

其中无氧环境和溶解氧浓度为2.5 mg/L条件下的变化趋势一致，均为pH 值持续增大到第9 d后下降并保持稳定。

但无氧条件的pH 值一直高于2.5 mg/L 溶解氧下的pH 值，这是因为在无氧条件下，细菌代谢更为旺盛，需消耗更多的H+。

而在4.5 mg/L 溶解氧下，pH 值总体仍然呈现上升趋势，最后稳定在7.5 附近。

在6.5 mg/L 溶解氧下，pH 值在第7 天就稳定在7.0附近。

从SRB 代谢原理可知，无氧条件下，SRB 代谢最为旺盛。

溶解氧浓度为2.5 mg/L 时，SRB 仍然能够存活，但代谢程度低于无氧条件。

在4.5 mg/L 溶解氧的作用下，SRB 代谢活动受到了明显的抑制；
而在6.5 mg/L 溶解氧的作用下，SRB 几乎全部失活。

图5 不同溶解氧浓度下SRB 溶液的pH 值随试验时间的变化Fig. 5 Canges of pH value of SRB solution with test time under different dissolved oxygen concentrations

图6 为不同溶解氧浓度下SRB 溶液浓度随试验时间的变化。

图6 不同溶解氧浓度下SRB 溶液浓度随试验时间的变化Fig. 6 Change of SRB solution concentration with test time under different dissolved oxygen concentrations

在无氧环境和2.5 mg/L 溶解氧下，SRB 浓度整体呈明显的上升趋势，但在2.5 mg/L 溶解氧环境中，SRB的生长已经得到了抑制。

在4.5 mg/L 和6.5 mg/L 溶解氧下，SRB 的生长几乎停滞，并且SRB 甚至呈负增长，充分说明SRB 在高溶解氧环境下，不仅代谢失活，还发生了彻底的死亡。

(1)页岩气集气管线内环境适宜SRB 生长繁殖。

(2)页岩气中存在的SRB 主要可以分为3 类，分别是Bacteroidota、 Firmicutes 和Desulfobacterota。

其 中Bacteroidota 和Desulfobacterota 均会产生H2S，从而加速管道腐蚀穿孔，威胁页岩气正常生产。

(3)SRB 在有氧条件下会受到一定的抑制，但仍然能够生长代谢，SRB 耐受氧的极限为4.5 mg/L。

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