管庆霞，周小影，刘宇萌，于欣，赵芳园（.黑龙江中医药大学，哈尔滨 50040；
2.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 50040）
甘草次酸（GA）及其衍生物的抗肿瘤作用已被广泛研究。GA可通过诱导细胞周期阻滞和激活半胱天冬酶依赖途径来诱导肝癌细胞凋亡，还通过下调血管内皮生长因子（VEGF）、淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表达来抑制肝癌的血管化和淋巴转移[1-2]。聚乙二醇（PEG）修饰的纳米给药系统可延长纳米粒在体内的循环时间，且透过细胞膜的能力增强。细胞内外存在氧化还原电位，而二硫键能够在细胞外环境中稳定存在，在还原性的细胞内环境中被谷胱甘肽（GSH）还原，肿瘤细胞中GSH的浓度比细胞外及正常细胞均较高，能够提供还原环境，使得二硫键发生断裂，实现高效释药的目的[3-4]。
马钱子碱具有抗炎、抗肿瘤及增强机体免疫力等作用，是一种高效的抗肿瘤单体，但水溶性差、具有毒性等缺点制约了其在临床上的应用[5-6]。如何将药物靶向于肝，使其更好地发挥疗效，已成为目前亟需攻克的难题。
本试验基于GA的肝靶向性及抗肿瘤的药理作用，PEG长循环特性及二硫键细胞内可断裂特点，将GA、PEG以及二硫键进行制备，构建GA介导的马钱子碱自组装纳米粒，以期提高马钱子碱生物利用度，发挥长效作用。采用HPLC法建立马钱子碱在血浆中含量测定的体内分析方法，经尾静脉注射后在不同时间点大鼠眼眶取血，HPLC含量测定后DAS 2.0软件对药时数据进行方程拟合，得出药动学参数，从而分析体内药动学差异。
DF-101Z恒温磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；
氮气吹干仪（BFC八方世纪）；
微型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；
e2695-2698高效液相色谱仪（美国Waters公司）；
离心机（上海安亭科学仪器厂）；
超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
十万分之一分析电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；
微量移液器（大龙合资）。
肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：1209124，规格：2 mL：12 500 U）；
B-GPSG-NPs冻干品、B-PSG-NPs冻干品（自制，载药量约2.58%）；
羟基酪醇（HT）对照品（批号：20130301，苏州皓翔化学科技有限公司）、马钱子碱对照品（批号：110706-200505，纯度均＞98%，中国食品药品检定研究院）。
SPF级SD大鼠，雌雄各半（200±20）g（批准文号2016101601，黑龙江中医药大学试验动物中心）。
2.1.1 GA介导的马钱子碱自组装纳米粒的制备 课题组前期通过酰胺、酯化等方法将GA、PEG以及二硫键进行制备，构建出GA介导的马钱子碱自组装纳米粒载体；
溶剂乳化超声法制备GA介导的马钱子碱自组装纳米粒；
制备成B-GPSG-NPs冻干粉[7]，GA介导的马钱子碱自组装纳米粒结构如图1所示。
图1 GA介导的马钱子碱自组装纳米粒结构图Fig 1 Structure of GA-mediated brucine self-assembled nanoparticles
2.1.2 GA介导的马钱子碱自组装纳米粒的表征
① 外观：B-GPSG-NPs冻干粉，外观均为白色疏松的固体粉末，色泽均匀，外观饱满且光洁细腻，轻轻振摇后能成块脱落，见图2。
图2 纳米冻干粉Fig 2 Freeze-drying powder of B-GPSG-NPs
② 形态观察：将B-GPSG-NPs冻干粉复溶后，经0.45 µm滤膜过滤，滴入覆有支持膜的铜网上，吸去过量液体，自然干燥，随后滴加浓度为2%的磷钨酸溶液，染色2～3 min，自然干燥，置于透射电子显微镜（TEM）下观察并拍照。结果见图3。冻干后粒径和形态基本没有变化，为分散均匀的圆球形纳米粒。
图3 B-GPSG-NPs透射电镜照片Fig 3 B-GPSG-NPs by TEM
③ 再分散性：取适量B-GPSG-NPs冻干粉样品3批，加入适量注射用水进行复溶，经数次轻轻振摇后，很快分散成均匀淡蓝色的纳米粒溶液，说明B-GPSG-NPs冻干粉再分散性良好（见图4）。④ 粒径及Zeta电位：取B-GPSG-NPs冻干粉用注射用水复溶后，得到纳米溶液，测定粒径及Zeta电位。结果其粒径为（108.91±8.62）nm，Zeta电位为（-19.63±3.40）mV，PDI为（0.187±0.005），粒径分布及电位见图5。
图4 B-GPSG-NPs冻干品复溶后的外观图Fig 4 B-GPSG-NPs after re-dissolving
图5 粒径分布图及电位图Fig 5 Particle size distribution and Zeta potential
⑤ 包封率及载药量的测定
采用低温超速离心法：量取3批B-GPSG-NPs溶液置于离心管中，超速离心（15 000 r·min-1，30 min），将沉淀的纳米粒收集，再用蒸馏水超声使其分散，继续离心，重复3次，取沉淀部分。精密量取B-GPSG-NPs混悬液，加色谱甲醇超声20 min（频率：40 kHz，功率：200 W），使纳米粒破乳，将包载的药物充分释放，过0.22 μm微孔滤膜，即得B-GPSG-NPs供试品溶液。同法制备不加药物的GPSG空白纳米粒溶液。过0.22 μm微孔滤膜，在流动相为甲醇-（水-乙酸-三乙胺＝230∶2.4∶0.3）（30∶70）；
色谱柱为Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
检测波长265 nm；
流速1 mL·min-1；
进样量20 μL；
柱温30℃条件下进样测定，计算包封率以及载药量。结果包封率及载药量分别为（68.37±1.83）%和（1.86±0.05）%，均略有增加，RSD均小于5%，与前期相比，重现性良好，工艺可行。
⑥ 稳定性评价：配制0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol·L-1的Na2SO4溶液，制备GPSG空白纳米粒，取0.5 mL的GPSG空白纳米粒溶液加入至2.5 mL不同浓度的Na2SO4溶液中，37℃静置10 min，560 nm波长处紫外检测各个样品的吸光度值，进行浓度-吸光度曲线的绘制，用于纳米粒的稳定性评价。
GPSG纳米粒与一系列浓度的Na2SO4溶液作用后的吸光度变化曲线见图6。由图6可知，当Na2SO4浓度低于0.7 mol·L-1时，体系的吸光度几乎没有变化，而当电解质浓度继续增加后，体系的吸光度突然增大，这可能由于随着电解质浓度的进一步增加，纳米粒子稳定性降低，体系吸光度发生突变。其临界絮凝浓度为0.7 mol·L-1，远远大于人体血液中的电解质浓度（主要成分为0.14 mol·L-1的钠离子和0.10 mol·L-1的氯离子），表明纳米粒子在电解质水溶液中具有高度的稳定性。
图6 纳米粒稳定性Fig 6 Stability of nanoparticles
2.2.1 色谱条件 流动相为甲醇-（水-乙酸-三乙胺＝230∶2.4∶0.3）（30∶70）；
色谱柱为Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
检测波长：265 nm；
流速：1 mL·min-1；
进样量：20 μL；
柱温：30℃。
2.2.2 血浆样品的处理 取大鼠血浆250 μL，加入内标（20 μg·mL-1羟基酪醇甲醇溶液）20 μL，加入100 μL的NaOH溶液（1 mol·L-1），涡旋1 min，超声20 min，放入2 mL萃取剂（二氯甲烷∶甲醇＝9∶1），涡旋5 min，超声溶解20 min，离心5 min（转速5000 r·min-1），收集下层液，上层血浆继续加2 mL萃取剂，重复上述操作，合并下层液，置于37℃水浴氮气吹干，用200 μL色谱甲醇复溶，涡旋2 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样测定。
2.2.3 专属性考察 取空白血浆、含马钱子碱对照品和内标物羟基酪醇对照品的血浆、尾静脉注射马钱子碱后的血浆样品，按“2.2.2”项下方法进行处理，结果见图7，血浆样品处理的过程中未引入干扰物质，马钱子碱与内标羟基酪醇的分离度良好，血浆的内源性物质对测定无干扰。
图7 高效液相色谱图Fig 7 HPLC chromatogram
2.2.4 线性关系的考察
① 马钱子碱溶液的配制：称取马钱子碱对照品2.60 mg置于25 mL量瓶中，用适量甲醇定容，即得质量浓度为104 µg·mL-1的对照品溶液，备用。
② 标准曲线的绘制：将马钱子对照品溶液，用空白大鼠血浆逐级稀释得到0.65、3.25、6.50、13.00、26.00、52.00 µg·mL-1系列质量浓度的对照品溶液，按“2.2.2”项下方法处理，横坐标（X）为血浆中马钱子碱质量浓度，纵坐标（Y）为对照品与内标物峰高之比，用加权最小二乘法进行回归运算，得标准曲线方程为Y＝0.038X+0.082，R2＝0.9986，马钱子碱在0.65～52.00 µg·mL-1内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度考察 精密量取马钱子碱供试品溶液200 μL（40.00、20.00、4.00 μg·mL-1），挥干有机溶剂加入等量空白血浆，按“2.2.2”项下方法处理后进样分析，记录峰面积，在日内、日间分别测定6次，考察其精密度。结果表明，日内与日间精密度RSD均小于10%，符合方法学要求。
2.2.6 稳定性考察 精密量取等量马钱子碱供试品溶液，分为高、中、低3个浓度（40.00、20.00、4.00 μg·mL-1）（n＝6），氮气挥干，将适量的空白血浆加入其中，室温静置6、12、24 h，分别取样并冷冻；
间隔1、2、3周后取样，按血浆样品的处理和进样分析，记录峰面积，结果RSD均小于5%，符合方法要求。
2.2.7 检测限及定量限 将马钱子碱对照品溶液不断稀释后进行分析，测得马钱子碱对照品溶液测定的检测限为0.428 µg·mL-1，定量限为0.650µg·mL-1。由此可见，该方法的灵敏度较高，能满足马钱子碱含量测定的要求。
2.2.8 回收率考察 精密量取52、13、0.65µg·mL-1的马钱子碱供试品溶液200 μL，各3份挥干有机溶剂，加入等量空白血浆，按“2.2.2”项下方法处理，进样分析，记录峰面积。马钱子碱峰高与未经提取的相同量对照品（甲醇液）的峰高比较，得马钱子碱的绝对回收率；
另将马钱子碱与羟基酪醇峰高之比代入标准曲线方法，计算测得药物浓度，与加入量比较，考察样品的方法回收率，结果见表1，符合生物样品的测定要求。
表1 回收试验结果(x±s，n＝3)Tab 1 Recovery (x±s，n＝3)
2.2.9 体内药动学研究
① 动物分组及给药：取18只健康大鼠，雌雄各半，随机分成3组，分别为原料药马钱子碱溶液组，B-GPSG-NPs溶液组以及B-PSG-NPs溶液组，于给药前的12 h进行禁食不禁水，采用尾静脉推注给药的方式，每组注射马钱子碱的剂量均为10 mg·kg-1。分别于给药后的不用时间点进行取血（眼底静脉丛毛细血管取血），取血时间点为10、30、60、90、120、150、180、210、240、300、420、600 min，取血量约为0.5 mL，随后置于涂有肝素钠的尖底离心管（规格：1.5 mL）中，6000 r·min-1离心10 min，取上层血浆，按“2.2.2”项下方法处理，进样分析，计算血药浓度。
② 血药浓度-时间：分别在给药后各时间点取血，进样测定后计算血药浓度。马钱子碱溶液组，B-PSG-NPs溶液组以及B-GPSG-NPs溶液组各时间点的马钱子的血药浓度值绘制三组的平均血药浓度-时间曲线，见图8。
图8 马钱子碱溶液组，B-PSG-NPs溶液组，B-GPSG-NPs溶液组中马钱子碱的血药浓度-时间曲线Fig 8 Plasma concentration-time curves of brucine in the brucine group，the B-PSG-NPs group and the B-GPSG-NPs group
由图8可知，B-GPSG-NPs溶液组与B-PSGNPs溶液组显著提高马钱子碱在体内的血药浓度；
显著延长了马钱子碱在体内的时间。B-GPSG-NPs经GA介导，较未介导的B-PSG-NPs不仅提高了血药浓度还延长了作用时间。
③ 药动学参数：通过运用DAS 2.0软件对所得进行血药浓度-时间曲线拟合，结合F检验，根据AIC值最小和拟合优度最优原则，可判定大鼠尾静脉注射马钱子碱溶液组、B-GPSG-NPs溶液组以及B-PSG-NPs溶液组后的血药浓度-时间曲线均符合权重因子为1/C2的二室模型，药动学参数见表2。
由表2可知，与马钱子碱溶液组相比，BGPSG-NPs溶液组和B-PSG-NPs溶液组AUC、tl/2α和t1/2β均显著增加，CL大大降低。B-GPSGNPs溶液组中药物的tl/2α、t1/2β分别是马钱子碱溶液组中药物的3.11、2.18倍，AUC值是溶液组中药物的3.7倍，血浆清除率是溶液组的0.31倍。B-PSG-NPs溶液组中药物的tl/2α、t1/2β分别是马钱子碱溶液组中药物的1.5、1.7倍，AUC值是溶液组中药物的3.2倍，血浆清除率是溶液组的0.36倍。
B-GPSG-NPs溶液组和B-PSG-NPs溶液组均改变了马钱子碱的药动学参数，B-GPSG-NPs溶液组效果更好，药物在大鼠体内的半衰期和体内滞留时间更长，更有助于提高药物的生物利用度，发挥长效作用。
GA介导的马钱子碱自组装纳米粒的体内药动学研究结果表明，B-GPSG-NPs溶液组、B-PSG-NPs溶液组与马钱子碱原料药组相比，马钱子碱溶液组在180 h，基本已代谢完全，而B-PSG-NPs溶液组以及B-GPSG-NPs溶液组药物在体内的作用时间延长，分别为420 h和600 h，达到长效缓释的效果，但B-GPSG-NPs溶液组更为长效，原因可能是GPSG载体有效地保护了药物，避免被酶类分解，有助于药物生物利用度的提高，从而达到长效的作用；
也有可能是GA水解后可生成18β-甘草次酸（β-GA），具有较大的位阻效应，对代谢具有一定影响，从而使其半衰期延长[8]。综上，若进一步优化及研究，GA介导的马钱子碱自组装纳米粒将有成为临床抗肿瘤治疗新剂型的潜力，对临床治疗有巨大的研究意义。
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