磷霉素氨基葡萄糖盐β-CD包合物的制备与研究

张尹萌，马强，金学平，祝宏*（.武汉工程大学化工与制药学院 新型反应器与绿色化学工艺湖北省重点实验室，武汉 430205；
2.武汉软件工程职业学院，武汉 430205；
3.武汉市药物增溶工程技术研究中心，武汉 430205）

1969年，磷霉素从链霉菌中分离得到，在临床上应用广泛，其作用机制是通过干扰细菌细胞壁的合成，从而达到抑菌效果，对多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌至今仍保持着较高的抗菌活性[1-2]。但磷霉素中的环氧基团在强酸、高温等条件下容易开环，结构不稳定，通常以盐的形式存在，从而获得较高的稳定性[3]，如磷霉素钙及磷霉素钠。因此，本课题组选用天然的D-氨基葡萄糖，利用拼合原理与磷霉素拼合在一起得到了磷霉素氨基葡萄糖盐（FA），并在先前研究中对其进行了结构鉴定和初步活性测试[4]。

目前，市面上常用的磷霉素钙和磷霉素钠分别以口服和注射方式给药，会不可避免地出现首过效应和不良反应，而在治疗呼吸道感染时若直接选用安全性高的抗菌药物经肺给药则能更好避免以上问题[5]。β-环糊精（β-cyclodextrins，β-CD）是一种对人体无害，性质稳定且常用的药用辅料。其内部的疏水性结构使其具有使包合的各种各样的化合物进入空腔内的能力，通过主客体相互作用与药物形成包合物，用以增加药物溶解度和稳定性，控制药物的释放[6-7]。为更好地解决FA中的环氧键在高温下易发生开环反应和引湿性强等问题，本研究采用冷冻干燥法制备FA-β-CD包合物，并对所制备的包合物进行表征，探究最佳包合工艺，同时对其进行抗菌活性及稳定性考察，为后续磷霉素类药物肺部给药制剂研究做准备。

1.1 仪器

MS105DU电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；
DZG-303A 超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）；
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海越众仪器股份有限公司）；
PHS-25 pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；
ZLGJ-10冷冻干燥机（河北盈盛仪器有限公司）；
WQF-510A傅里叶红外光谱仪（安捷伦科技股份有限公司）；
BrukerAXS D8 Advance X射线光电子能谱仪（德国布鲁克公司）；
SDH-150型恒温恒湿箱（上海佐诚实验仪器有限公司）。

1.2 试药

FA（实验室自制）；
β-CD、盐酸、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；
磷霉素钙（武汉五景药业有限公司，批号：20180715，纯度≥98%）；
其余试剂均为分析纯，水为实验室自制纯化水。

2.1 药物含量的测定

现行的药物质量标准采用微生物检定法测定磷霉素含量，操作复杂，结果易受操作者主观影响[8]。磷霉素在大于220 nm处无紫外吸收，无法利用紫外分光光度计直接测定FA含量；
HPLC-ELSD法能同时测定磷霉素及相关杂质含量，但耐用性差，结果难以重现。因此，本研究参考《中国药典》方法，通过电位滴定测定样品溶液中磷酸基团的含量进而换算出药物中磷霉素的含量[9]。

2.1.1 电位滴定测定FA含量 取一定量的FA，用0.1 mol·L-1的盐酸溶解，加入搅拌磁子进行电磁搅拌，用标定过的0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液缓慢滴定，记录待测液pH和电位的变化，直至出现第二次突跃，pH约为11.5时可停止滴定。另取空烧杯，加入10 mL 0.1 mol·L-1的盐酸进行空白对照滴定实验。通过二阶微商计算突跃时消耗0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液体积，并根据以下公式计算FA含药量。

W＝（V-V1）×C×M×10-3/2m×100%

式中，V为滴定FA时消耗氢氧化钠溶液的体积（mL），V1为空白试验中消耗氢氧化钠溶液的体积（mL），C为氢氧化钠标定后的浓度（mol·L-1），m为称取FA的量（g），M为磷霉素的相对分子质量138.06 g·mol-1。

2.1.2 包合物包合率和收率测定 取包合物0.1 g，按“2.1.1”项下方法进行电位滴定计算包合率，另采用称重法计算收率，计算公式如下所示。

收率（%）＝（所得的包合物的质量）/（FA和β-CD总质量）×100%

包合率（%）＝（包合物中的含药量）/（FA中的含药量）×100%

2.2 FA-β-CD包合物的制备

经过预实验，选用β-CD作为FA的包合材料，采用冷冻干燥法制备包合物。取β-CD 1 g，溶解于适量纯化水中，在30℃下恒温搅拌2 h，配制成β-CD饱和溶液。待溶液澄清后加入1 g FA，继续在该温度下搅拌包合1 h，待冷却至室温后，放入冰箱预冻24 h，再进行冷冻干燥除水，得FA-β-CD包合物。另外，按照质量比1∶1，分别称取适量的β-CD和FA，置于研钵中研磨混匀，制备FA和β-CD物理混合物。

2.3 包合物制备的工艺优化

2.3.1 质量比对包合率和收率的影响 一般来说，在包合物制备过程中，主客体分子比例越高，β-CD所提供的分子腔数量也就越多，药物分子也更容易进入空腔被包合[10]。根据“2.2”项下方法制备，保持水浴温度为30℃、包合时间为1 h不变，考察m（β-CD）∶m（FA）＝0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、1.75∶1对FA的包合率和收率的影响。结果如图1所示，以冷冻干燥法制备FA-β-CD包合物时，包合率随着主客体质量比的增加呈现先升后降的趋势。当主客体质量比为0.75∶1时，主分子β-CD提供的空腔不足以让客分子FA充分进入；
当m（β-CD）∶m（FA）为1.25∶1时，包合率最高，达到89.44%；
此后继续增加β-CD的用量也无法提高FA的包合率。由图1还可得知，FA-β-CD包合物的收率受主客比影响不大，但随着主客比的增大，β-CD用量增加，在影响包合率的同时，成本也增加。因此，m（β-CD）∶m（FA）＝1.25∶1为最佳质量比。

图1 m（β-CD）∶m（FA）对包合率和收率的影响Fig 1 Influence of m（β-CD）∶m（FA）on the inclusion rate and yield

2.3.2 包合时间对包合率和收率的影响 在m（β-CD）∶m（FA）为1.25∶1，包合温度为30℃的条件下，考察包合时间1、2、3、4、5 h时对FA的包合率和收率的影响。结果如图2所示。随着包合时间的延长，FA的包合率和收率均呈现先升后降的趋势，当包合时间为2 h时，β-CD对FA的包合率和收率达到最高，分别为92.30%和89.34%；
继续增加包合时间，包合率和收率不增反降，这可能是因为当包合时间达到2 h，FA进入β-CD空腔的速度与从空腔中脱离的速度达到平衡，因此，继续增加包合时间，包合率也无法上升。而且，随着包合时间的延长，研究的时间成本增加，最后选择2 h为最佳包合时间。

图2 包合时间对包合率和收率的影响Fig 2 Influence of inclusion time on the inclusion rate and yield

2.3.3 包合温度对包合率和收率的影响 温度也影响着包合效果，在m（β-CD）∶m（FA）为1.25∶1，包合时间为2 h时，考察包合温度在20、25、30、35、40℃时对FA的包合率及收率的影响。由图3可知，随着包合温度升高，FA的包合率逐渐降低，当包合温度为20℃时包合率最大，为90.35%。

图3 包合温度对包合率和收率的影响Fig 3 Influence of inclusion temperature on the inclusion rate and yield

因此，FA-β-CD包合物的最佳制备工艺为m（β-CD）∶m（FA）＝1.25∶1，包合时间为2 h，包合温度为20℃。

2.4 包合物的鉴定

FA经过β-CD包合后，需要对得到的包合物进行鉴定，常用的鉴定方法有以下几种：电镜法、红外光谱法（IR）、X射线衍射法（XRD）以及薄层色谱法（TLC）等[11]。本实验运用IR和XRD两种方法对FA-β-CD包合物进行鉴定。

2.4.1 IR 本研究使用傅里叶变换红外光谱仪，采用溴化钾压片制样，分别测定β-CD、FA、FAβ-CD包合物及FA和β-CD的1∶1物理混合物的红外光谱。结果见图4，FA的红外光谱在3300 cm-1左右出现分子间氢键O-H伸缩振动，属于氨基葡萄糖分子上的羟基缔合形成的宽吸收峰，在与磷霉素反应生成FA后，在1600 cm-1到1750 cm-1处出现多个N-H的特征吸收峰。FA-β-CD包合物的红外图谱与β-CD的红外图谱相似，在1600～1750 cm-1是一个宽峰，这是与FA及两者的物理混合物是明显能区别开的，初步说明FA成功包合进入β-CD的空腔内。

图4 样品的 IR 图谱Fig 4 Infrared spectroscopy pattern of the samples

2.4.2 粉末XRD 分别将FA、β-CD、FA和β-CD的1∶1物理混合物以及FA-β-CD包合物这4种样品进行粉末XRD分析，扫描速度为2θ，角度为5°到50°。从图5扫描结果可以发现，FA的粉末衍射图有清晰且尖锐的晶体衍射峰，说明其具有明显的晶体结构。而β-CD几乎没有峰，说明其为无定型粉末。两者的物理混合物中几乎所有的特征峰都存在，而FA-β-CD包合物的晶体衍射峰明显减弱，表明粉末失去晶体结构转变为无定型状态，证明FA-β-CD包合物包合成功。

图5 样品的粉末 XRD 图谱Fig 5 X-ray powder diffraction pattern of the samples

2.5 抑菌活性实验

2.5.1 主要试剂配制 分别称取适量磷霉素钙、FA、FA-β-CD包合物，加纯化水溶解配成实际含磷霉素1 mg·mL-1的溶液；
另配制相同浓度不含药的β-CD溶液。

2.5.2 菌悬液的制备 用接种环分别从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、铜绿假单胞菌（Pae）、鲍曼不动杆菌（Ab）中挑取菌落，接种于200 mL液体培养基中，将培养基置于恒温振荡器中，在37℃、120 r·min-1的条件下培养18～20 h，备用。

2.5.3 微量肉汤稀释法测定MIC取各溶液和液体培养基各100 µL混匀，依次倍比稀释置于96孔板中，在每个孔加入80 µL液体培养基及20µL菌悬液，使待测液质量浓度梯度依次为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 µg·mL-1；
在其后一孔加入共180 µL液体培养基和20 µL菌液，最后一孔加入200 µL液体培养基作为对照，在37℃恒温箱培养24 h，测量药品对3种细菌（MRSA、Pae、Ab）的MIC值。平行重复实验3次，结果如表1所示，β-CD完全没有抗菌活性，对测试结果不会产生干扰。相比于MRSA和Pae，Ab具有更强的耐药性。各样品对MRSA、Ab的作用效果表现一致，对Pae的抗菌活性表现为FA-β-CD包合物弱于FA，FA弱于磷霉素钙，推测β-CD包合FA后可能对药物释放有所影响，另外可能需要进一步优化FA的拼合工艺使其药效发挥更加稳定。但从整体上来看，FA及其包合物的抗菌活性与磷霉素钙相比并无太大差异，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都能展示出较好的抑菌效果。

表1 抗菌活性测试结果(MIC，µg·mL-1)Tab 1 Antibacterial activity test (MIC，µg·mL-1)

2.6 稳定性实验

FA容易吸潮，不易储存，以表2中所列指标考察样品稳定性。分别将FA和FA-β-CD包合物用生理盐水配制成磷霉素浓度相同的溶液，再与FA和FA-β-CD包合物固体样品一起放置于40℃恒温恒湿箱中，做遮光处理。于第5日检查溶液的颜色、气味、pH值变化以及固体样品的增重情况。结果如表2所示，在40℃避光的条件下，FA增重明显，其溶液的颜色、气味以及pH变化也较大；
而FA-β-CD的重量及其溶液的颜色和气味变化均较小。因此，经过β-CD包合后的FA更加稳定，尤其是其强引湿性得到了很好的改善。另外，按“2.5.3”项下方法，利用Pae对FA-β-CD包合物溶液进行活性测试，在8 h内其抗菌效果未减弱，这对于现配现用的溶液来说，可满足稳定性要求。

表2 FA及FA-β-CD包合物的稳定性Tab 2 Stability of FA and FA-β-CD inclusion complex

3.1 FA-β-CD包合物制备工艺优化

本实验以β-CD作为载体，采用冷冻干燥法制备了FA-β-CD包合物。包合物的形成需要一定的时间，主客体质量比和包合温度会影响最终包合效果。在包合过程中，FA借助外力逐渐进入到β-CD空腔中，两者分子间相互作用，β-CD的量不足时会导致FA包合不全，过多时又会因其浓度过高反而阻碍FA进入空腔。只有在合适温度下，主客比适量，包合达平衡时才能取得最佳包合效果。因此，本研究以包合率和收率为指标，通过单因素实验筛选出了最佳的制备工艺，即m（β-CD）∶m（FA）为1.25∶1，包合时间为2 h，包合温度为20℃。

3.2 FA-β-CD包合物的鉴定

药物的分子结构决定着其红外区的吸收特征，采用β-CD对FA包合后，可根据FA红外吸收峰的位移以及吸收峰的减弱或消失来判断包合效果[12]。另外，X-射线衍射性质也会随着结晶性药物被包合后的结晶度的改变而发生一些变化，结晶度高的药物通常会有较强的衍射特征峰，而经过β-CD包合后，样品结晶程度会下降或者消失，在X-射线衍射图谱上则表现为原有的特征吸收峰消失或减弱。因此，本文通过红外光谱分析和X-射线衍射对样品进行表征，证实了FA-β-CD包合物的形成。

3.3 FA-β-CD包合物的抗菌活性和稳定性

经抗菌活性测试发现，FA及FA-β-CD包合物对Pae的抗菌效果弱于对照品磷霉素钙。可能是β-CD包合FA后会对药物释放产生影响，另外，也需要进一步优化FA的拼合工艺使其药效发挥更加稳定。但从整体结果来看，FA及FA-β-CD包合物均能有效对抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。而且，经过稳定性观察发现，FA-β-CD包合物几乎不吸潮。因此，本次研究证明了β-CD是合适FA的包封材料，采用冷冻干燥法制备FA-β-CD包合物时不会明显影响FA的抗菌活性，且能明显改善FA的强引湿性，有利于药品的储存和应用。这也为后续进一步的制剂研究提供了一定参考。

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