2018-2019年昆明市住院新生儿轮状病毒感染及基因型分析

许小艳，孔 宁，甸子芩，杨景晖，田云粉，苏丽娜，米弘瑛△

(1.云南省第一人民医院儿科，昆明 650032；
2.云南省昆明市儿童医院检验科 650034；
3.云南省第一人民医院检验科，昆明 650032)

轮状病毒(rotavirus，RV)是世界范围内引起儿童非细菌腹泻的最主要病原体，也是5岁以下儿童腹泻死亡的首要原因[1]。新生儿感染RV的临床表现及基因型有一定的特殊性[2]，但目前RV相关研究对象大多数为5岁以下的婴幼儿，针对新生儿RV感染研究资料较少。本研究对2018-2019年昆明某三级甲等医院住院新生儿进行粪便RV抗原检测，收集临床资料，进行RV基因型分析，旨在了解昆明地区新生儿RV感染的临床及分子流行病学特征，为RV感染的防治提供依据，现报道如下。

1.1 一般资料

选取2018年1月至2019年12月在昆明某三级甲等医院新生儿病房住院的5 092例新生儿为研究对象。本研究获医院伦理委员会批准(批准号：2017YYLH039)。

1.2 方法

1.2.1标本及临床资料收集

所有患儿入院48 h内检测粪便RV抗原，入院48 h后出现腹泻、呕吐、腹胀、喂养不耐受等消化道症状体征时复测粪便RV抗原。RV抗原阳性病例收集粪便标本经离心处理后冻于-80 ℃冰箱，用于RV基因分型。同时收集RV阳性新生儿的临床资料，包括胎龄、日龄、性别、分娩方式、出生体重、住院日期、住院病房类型、喂养方式、RV检查时间和临床表现等。

1.2.2RV抗原检测

采用艾博生物医药(杭州)有限公司RV抗原检测试剂盒(乳胶法)检测粪便标本中RV抗原，操作方法严格按说明书进行。

1.2.3RV基因分型

1.2.3.1提取病毒RNA

取200 μL 10%的粪便悬液，采用TIANamp Virus RNA Kit提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取病毒RNA，操作方法严格按说明书进行。

1.2.3.2逆转录PCR(RT-PCR)检测

提取病毒RNA的阳性标本，以病毒的VP4和VP7核苷酸序列为模板，运用巢式RT-PCR方法(日本TaKaRa公司Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit)对RV进行基因分型。参照文献[3]设计VP7和VP4基因特异性引物及反应体系。第1轮PCR反应条件：50 ℃ 30 min；
94 ℃ 2 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃ 5 min，4 ℃,无限循环。第2轮PCR反应条件：94 ℃ 290 s；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；
72 ℃ 5 min，4 ℃,无限循环。

1.2.3.3基因测序与序列分析

标本的基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，以VP4(P分型)和VP7(G分型)内围扩增引物为测序引物，正反向双向测序。将测序得到的基因序列提交至互联网(http://www.ncbi.ulm.nih.gov)，运用 BLAST工具进行碱基比对分析，确定G/P 基因型。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0软件进行数据分析，计数资料以频数或百分率表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 住院新生儿RV感染情况及季节分布

5 092例住院新生儿中共检出粪便RV抗原阳性136例，总检出率为2.67%。社区感染占总感染人数的64.71%(88/136)，医院感染占35.29%(48/136)。新生儿RV感染全年均可发生，12月至次年2月为流行高峰季节，检出率为3.32%～5.53%；
其次为3-5月，检出率为2.48%～3.10%；
9月检出率最低(1.45%)。社区感染及院内感染高峰期基本一致，但3-5月社区感染检出率明显下降，院内感染检出率仍较高。

2.2 住院新生儿RV感染的临床表现

136例RV感染的新生儿中，41例(30.15%)为无症状感染，95例(69.85%)有腹泻、呕吐和发热等RV感染相关临床症状。最常见的临床症状为腹泻，腹泻发生率为60.29%(82/136)，大便多为黄色或黄绿色稀糊便或水样便，每日4～11次，部分伴轻度脱水、腹胀、吃奶差、精神差及哭闹等表现，但多为3～7 d 恢复正常。其次为发热，20例(14.71%)出现发热，体温在37.5～39.0 ℃，6例(4.41%)以发热为唯一或首发症状。7例(5.15%)有呕吐表现，还有13例(9.56%)表现为便血、喂养不耐受及新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)等其他症状，其中NEC 2例。

比较RV感染的早产儿及足月儿临床症状发现，早产儿无症状感染发生率略高于足月儿，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。足月儿腹泻发生率高于早产儿，而早产儿其他症状的发生率高于足月儿，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 RV感染早产儿与足月儿临床症状比较[n(%)]

2.3 新生儿RV感染基因型特征

2.3.1RV的基因多样性

本研究共收集2018-2019年RV感染新生儿粪便标本101例，扩增并测序成功的VP7及VP4基因有89例(88.12%)。G分型中分出3种已知基因型，依次为G9、G2、G8。P分型中分出2种已知基因型P[8]和P[4]，最后确定本研究标本中共检出4种基因型，主要基因型为G9P[8]，其次为G2P[4]、G2P[8] 及G8P[8]，见表2。

表2 昆明地区新生儿RV基因型分布[n(%)]

2.3.2RV主要基因型在不同分类新生儿中的分布

G9P[8]、G2P[4]基因型RV在不同胎龄、住院病房、日龄、感染方式及有无症状的新生儿中分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 RV主要基因型在不同分类新生儿中分布[n(%)]

2.3.3RV主要基因型在不同症状新生儿中的分布

G9P[8]、G2P[4]基因型RV在腹泻和无腹泻、发热和无发热新生儿中分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 RV主要基因型在不同症状新生儿中的分布[n(%)]

3.1 昆明地区住院新生儿RV感染率及季节性分布

新生儿RV感染主要来源于孕产妇感染、产道感染及医院内感染，医院里可通过医护人员造成RV的传播。文献报道NICU的新生儿RV检出率为25.2%～43.9%，且医院内感染占较大比例[2,4]。新疆地区新生儿病房RV感染的总检出率为14.22%，院内感染占60.07%[5]。袁娇等[6]报道NICU中RV检出率为5.91%。本研究结果显示昆明地区2018-2019年住院新生儿RV检出率为2.67%，其中社区感染占总感染人数的64.71%，医院感染占35.29%，总检出率及院内感染占比均低于上述文献。考虑为各地区气候环境不同，RV感染检测力度及医院内感染的防治措施也不同，造成RV感染率地区差异。流行病学调查显示，2005-2018年中国5岁以下儿童RV感染自9月开始上升至次年2月或4月回落，发病高峰季节为11月至次年2月[7]。昆明地区5岁以下儿童RV感染发病高峰期为每年的1-3月和10-12月[8]。本研究中新生儿RV感染的高峰期为12月至次年2月，与上述报道的5岁以下儿童RV感染流行季节高峰相符。但3-5月仍维持较高的感染率，9月感染率最低，与婴幼儿流行季节特点不完全相同。本研究中新生儿RV医院内感染与社区感染的季节分布基本一致，不同的是3-5月社区感染率已明显下降，但医院内感染率仍高，说明医院内感染在RV流行高峰期后仍会持续一段时间，临床需重视新生儿病房RV医院内感染的防控。

3.2 新生儿RV感染的临床表现

新生儿感染RV后可表现为无症状或轻型感染，也可表现为典型急性胃肠炎，还可表现为生命体征不稳定、喂养困难、NEC等严重症状[2,9]。本研究中30.15%的新生儿表现为无症状感染，69.85%的患儿有临床症状，最常见的临床症状为腹泻，发生率为60.29%，部分伴轻度脱水、腹胀、吃奶差、精神差及哭闹等表现，但多于3～7 d恢复正常。其次为发热及呕吐，另有9.56%的患儿以便血、喂养不耐受及NEC等为主要表现。所以临床应给予及时有效的补液治疗以缓解腹泻相关症状，同时应注意患儿的其他表现，避免并发症发生。有研究报道，新生儿感染RV后最常见症状是发热而不是腹泻或呕吐[10]。本研究中新生儿RV感染后发热的发生率为14.71%，且有4.41%的患儿以发热为首发或唯一症状，说明有必要对发热的新生儿进行粪便RV检测。本研究还发现足月儿感染RV后腹泻发生率高于早产儿，与郑灵玲等[5]研究结论一致。早产儿喂养不耐受、便血及NEC等其他症状的发生率高于足月儿，但早产儿因胃肠功能不成熟及并发症多等原因，即使不感染RV发生上述症状的风险也高于足月儿，且本研究为单中心研究，早产儿RV感染例数较少，不足以说明RV感染与早产儿喂养不耐受及NEC相关，尚需开展多中心研究，并排除干扰因素后进一步分析。

3.3 昆明地区新生儿RV基因型特征

RV基因型分布存在明显地区及时间差异。G9P[8]型于1983年最初在美国发现，此后的10年关于G9型RV的报道较为少见，2000年以后G9P[8]型RV开始在世界各地零星暴发。在中国，G9型病毒最早于1998年在云南发现，此后该型病毒仅作为少见基因型偶然被报道。直至2011年，G9P[8]型RV快速取代了G1P[8]和G3P[8]型RV成为南京和武汉等地的优势基因型。2009-2015年中国5岁以下腹泻儿童RV流行监测显示，RV优势株从G3P[8]和G1P[8]迅速演变为G9P[8]，其中G9P[8]的比例从2009年的3.4%明显增加到2015年的60.9%[11]。荟萃分析显示，2011-2018年中国5岁以下儿童RV最普遍基因型是G9P[8]，占20.9%[12]。说明该型RV已经成为中国的优势株。

昆明作为云南省会，是连接省内外的经济和交通枢纽，建立以昆明为中心，辐射全省的RV感染和基因多样性筛查网具有重要意义。昆明地区2006年以前婴幼儿流行的RV以G1和G3P[8]为主。但由于此后近10年未对本地区流行的RV基因型进行监测，缺乏该时间段内RV的分子流行病学数据。而甸子芩等[8]对本地区2015-2017年RV流行病学调查显示，G9P[8]型已成为本地区的优势流行株，其次为G2P[4]型，G1P[8]和G3P[8]型明显减少。本研究中新生儿最主要流行的基因型为G9P[8]型，占76.41%，与本地区婴幼儿优势流行株一致。近年在实施 RV 疫苗接种的国家中观察到G2P[4]型RV毒株的流行率暂时增加[13-14]。文献报道，昆明地区感染该基因型的儿童中年龄在2岁以下的占46.7%[3]。本研究中，G2P[4]型占21.35%，为本地区新生儿流行次要优势株，说明该基因型已在昆明地区婴幼儿及新生儿中流行。遗憾的是，之前的研究均是针对婴幼儿或年龄更大的儿童，昆明地区新生儿RV基因型监测一直处在空白状态，无法确定这两种基因型在新生儿这一群体中的具体流行时间。

另外，新生儿感染的G9P[8]和G2P[4]两个主要基因型在不同胎龄、住院病房、日龄、感染方式及有无症状的新生儿中分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。在腹泻和无腹泻，发热和无发热等不同症状的新生儿中分布亦无差异(P>0.05)。表明感染RV的基因型与胎龄、住院病房、日龄、感染方式与感染基因型无相关性，不同临床症状与感染基因型也无相关性。但本研究鉴定基因型的RV例数较少，可扩大样本量或开展多中心研究进一步探讨RV基因型与临床特征是否相关。

G1P[8]是韩国儿童中最常见的基因型，G4P[6]是新生儿中最常见的基因型，但2017-2018在新生儿中首次高频率检测到G8P[6]型的RV株[15]。在印度南部，G10P[11]型是新生儿感染RV的主要基因型，而这一基因型在其他年龄儿童中少见[16]。以上研究提示新生儿RV流行基因型与婴幼儿可能不同，且有少见病毒株在新生儿群体中流行。本研究中新生儿RV流行的主要基因型与本地区婴幼儿一致，但分别检测到1株G2P[8]及1株G8P[8]型，这两种基因型此前未在本地区儿童中检出，表明需动态监测新生儿RV流行基因型变化趋势，警惕少见基因型在新生儿中流行。

综上所述，昆明地区住院新生儿RV感染率较低，流行季节特征与婴幼儿不尽相同，医院感染在流行高峰期后仍会持续一段时间，新生儿感染RV后以腹泻症状最常见，足月儿更容易出现腹泻症状，无症状感染及发热在RV感染的新生儿中占一定比例。需重视无症状感染及医院内感染，并开展发热新生儿的RV检测。新生儿RV主要流行基因型为G9P[8]、其次为G2P[4]，有少见的G8P[8]及G2P[8]检出，需动态监测本地区新生儿RV流行基因型变化趋势，并警惕少见基因型在新生儿中流行。

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