紫苏籽蛋白协助泡沫分离去除亚甲基蓝

＊孙宇格 陈林 姚楠 赵春全 胡楠

（中北大学化学与化工学院 山西 030051）

染料主要应用于染色纺织纤维，赋予生活的色彩。近年来，随着纺织印染工业的迅速发展，染料废水的排放日益增多，大量染料废水排放到各类水体中，造成水资源的严重污染，也对人类的健康造成极大的威胁[1]。染料废水具有复杂的物理和化学成分，色泽深、臭味大、生物毒性强，难以降解，如不妥善处理，将对生态环境造成破坏。随着我国对水资源的保护力度不断加大，处理染料废水是十分必要的。

如今，已有多种方法用于去除染料废水中的污染物，如混凝沉降法、吸附、离子交换、生物降解、泡沫分离等[2]。在众多方法中，泡沫分离技术（Foam fractionation）依据表面吸附原理进而实现溶液中溶质或颗粒的回收和富集，其具有条件温和、能耗小、易放大、分离效果好的优点，是有效去除染料废水的方法之一。由于染料不具有表面活性，因此需要向染料废水中加入起泡剂和捕收剂进行泡沫分离。目前化学合成的表面活性剂常被用作起泡剂或捕收剂，尽管其应用广泛，但很难被生物降解、且具有毒性，而生物表面活性剂具有无毒无害、可生物降解、性能优异等优势[3]，可被用作泡沫分离的新型助剂。

紫苏籽（Perilla seeds，PS）是紫苏的成熟果实，一般呈灰棕色或灰褐色的类球型，表面有花纹，压碎有香味，可以入药、作调料和防腐剂等。紫苏籽中的蛋白质（Perilla seed protein，PSP）含量约为20%～23%[4]，具有两亲的分子结构，作为起泡剂能够产生大量泡沫，作为捕收剂也能够与染料进行有效结合，因此紫苏籽蛋白可作为泡沫分离所需生物表面活性剂的来源之一。本文以碱性染料亚甲基蓝（Methylene blue，MB）作为待去除染料，创新性地以紫苏籽蛋白为起泡剂和捕收剂，通过研究PSP对MB泡沫性能和分离效果的影响，最终实现绿色高效处理染料废水。

(1)实验材料与仪器

PS由中北大学晋中产业技术创新研究院提供；
亚甲基蓝购于Adamas-beta公司；
无水乙醇，磷酸均购于上海泰坦化学有限公司；
氢氧化钠，盐酸均购于天津市化学试剂制造有限公司；
牛血清蛋白购于阿拉丁试剂（中国）有限公司；
考马斯亮蓝G-250购于北京谨明生物科技有限公司；
所用试剂均为分析纯。实验所用模拟水样的水质情况如表1所示。

表1 MB模拟废水水质情况

FA1204B型电子天平（天津德安特仪器有限公司）；
PHS-3C型pH计（上海仪分科学仪器有限公司）；
SG-4050C型数显恒温水浴锅（常州国华仪器有限公司）；
JJ-1A型数显电动搅拌器（金坛市杰瑞尔有限公司）；
UV-5200PC型分光光度计（上海元析仪器有限公司）；
ACO-004型电磁式空气压缩机（饶平县兴成机电水族用品有限公司）；
转子流量计（天津河东五环仪表厂）；
SC-3416型低速离心机（中佳中科科教仪器有限公司）；
LGJ-12N型真空冷冻干燥机（北京亚星仪科公司）；
BJ-400型高速多功能粉碎机（莱州市恒达塑料机械有限公司）；
JK99B型表面张力仪（上海中晨数字技术设备有限公司）；
BT100-2J型蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）。

(2)紫苏籽蛋白的提取方法

先将紫苏籽用高速多功能粉碎机粉粹，再过60目筛得到紫苏粉。参照张可可[4]的方法制备紫苏籽蛋白，首先将紫苏粉溶解于pH为7.0～11.0的NaOH的水溶液中，按200:1～700:1的液料比，在搅拌速度为250～450rpm和温度为30℃的条件下搅拌2～20min来提取紫苏粉中的蛋白，其次以3500r/min的条件离心20min获得上清液，用稀盐酸将其pH调整至4.4，随后以2000r/min的条件离心10min，然后将得到的沉淀物用水洗出溶解，最后用稀碱液来调整溶液pH至中性，冷冻干燥后获得紫苏籽蛋白。

(3)紫苏籽蛋白含量的测定

本实验采用考马斯亮蓝G-250比色法来测定紫苏籽蛋白质含量，绘制牛血清白蛋白标准曲线，标准曲线回归方程为：y=0.0066x+0.1285，R2=0.9998。

(4)紫苏籽蛋白浸提液提取效果评价

以紫苏蛋白提取率为参数对紫苏籽蛋白提取率进行评价，其公式如下：

其中，Y为蛋白提取率，%；
M1为提取物质量，g；
M2为紫苏饼粕质量，g。

(5)表面张力的测定方法

参照李远非等[5]的方法来测定表面张力，首先将表面张力仪调零，将试样放于样品台，升高样品台，使铂金板浸入液面以下3mm左右，然后缓慢降低样品台使铂金片与液面持平，待示数稳定后记录数值，不清洗铂金板，重复测定三次，取其平均值作为测定结果，且标准差不大于0.03mN·m-1。

(6)实验过程

连续泡沫分离实验是将不同PSP浓度与pH值的MB废水通过蠕动泵以恒定流速从两相（液相—泡沫相）交界处送入浮选塔。通过调节浮选塔底部阀门使残液以恒定的流速排出，使两相交界处维持在一定高度。压缩空气以200mL/min的速度由空气压缩机经缓冲瓶、润湿瓶、转子流量计和气体分布器泵入浮选塔内。随着泡沫层的上升，泡沫流入塔顶的收集器，进行消泡，待泡沫不再溢出时停止实验。实验分离装置如图1所示，浮选柱由透明有机玻璃制成，底部是由烧结玻璃制成的气体分布器，浮选柱内由液相和泡沫相两相组成，其截面直径为45mm，总高度为1000mm。

图1 连续泡沫浮选装置示意图

(7)泡沫性能检测方法

泡沫性能测试参照胡楠等[6]的方法，向透明有机玻璃柱中加入200mL的紫苏籽蛋白溶液，以300mL·min-1的恒定速率向溶液鼓入气体，记录60s内产生的泡沫高度Hf和泡沫相下降到一半高度所需的时间T1/2。

(8)亚甲基蓝浓度的测定方法

亚甲基蓝浓度的测定方法参照李伟等[7]的方法，在波长665nm下，使用紫外-可见分光光度计测量吸光度，通过标准曲线计算得到亚甲基蓝的浓度。其中标准曲线为A=0.2014CMB-0.007，R2=0.9997，A为吸光度，CMB为亚甲基蓝浓度。

(9)泡沫分离去除染料的效果评价

泡沫分离去除染料效果由去除率RMB、富集比EMB、吸附密度Γ和持液率εout四个参数进行评价，定义如下：

其中，C0、Cr、Cf和Cf1分别为原料液、残液、消泡液和1min内消泡液亚甲基蓝染料浓度，mg·L-1；
V0、Vr、Vf、Vf1和VG分别为原料液、残液、消泡液、3min内消泡液和3min内气体流过的气体体积，mL；
Qf为消泡液的体积流率，mL·min-1；
d为气泡直径，mm。通过对泡沫相拍照，使用软件Nano Measurer 1.2对照片处理，随机选取100个气泡，计算平均值，得到气泡平均直径。

(1)不同提取时间与pH对PSP提取率的影响

如图2（a）所示，PSP提取率在pH值小于9.0时，随pH值的升高而提高，在pH值等于9.0时提取率达到最大值40.26%，在pH值大于9.0时随pH值的升高而减少，这是因为PSP在碱性条件下能够更好的溶解在溶液中，但过强的碱性会使少量PSP变性失去生物活性，导致提取率降低。PSP提取率随时间的变化趋势为：先不断增加，在8min后维持在40.2%左右，上下波动不超过0.5%，此现象的原因是随着搅拌时间加长，碱提液中的PSP在8min时已经将大部分的PSP溶出，且搅拌时间过长时，细胞内水解蛋白质的酶也随之溶出，PSP的分子结构破坏，导致蛋白质变性[4]。

图2 pH与提取时间(a)和液料比与搅拌速度(b)对PSP提取率的影响

(2)不同液料比与搅拌速度对PSP提取率的影响

如图2（b）所示，PSP的提取率随液料比的变化有先不断增加后维持稳定的规律，在500:1后PSP提取率基本维持不变，为42.1%。PSP的提取率随搅拌速度的变化有先不断增加后下降的规律，在350rpm的搅拌速度下PSP的提取率达到42.1%；
在较低的搅拌速度下，提取液体系的物料无法达到均匀状态，PSP不能完全溶出，所以PSP提取率较低；
在较高的搅拌速度下，剧烈的机械搅拌会对提取液体系施加较大的剪切力，PSP的结构受到破坏，导致PSP变性失活，从而降低PSP提取率。

综上，确定适宜的提取条件为：pH值9.0、液料比500:1mL/g、提取时间8min、搅拌速度350rpm，该条件下紫苏籽蛋白提取率为42.1%。

(3)PSP对泡沫分离MB过程中的泡沫性能的影响

表面张力的下降是起泡的前提，本节就不同浓度PSP对MB废水表面张力进行测量，结果如图3（a）所示；
通过泡沫高度Hf和泡沫半衰期T1/2评价不同PSP浓度对MB废水的静态泡沫性能的影响，结果如图3（b）所示。由图3（a）可知，未添加PSP的MB废水表面张力为72.8±1.9mN·m-1，与蒸馏水的表面张力近似相等；
加入PSP后，MB废水表面张力随着PSP浓度的升高降低，当PSP浓度达到300mg·L-1，废水表面张力趋于稳定；
该现象是由于MB溶液无表面活性，加入PSP后其可自发吸附在气液界面，发生构象变化和分子重排、造成表面张力的降低[8-9]。当PSP浓度继续升高时，PSP形成胶束，表面张力不再降低。如图3（b）所示，未添加PSP的MB废水由于MB无表面活性，泡沫高度和半衰期均为0；
加入PSP后泡沫性能明显增加，随着PSP浓度的升高，MB废水的Hf和T1/2也呈上升趋势。该现象是因为PSP吸附在气液界面上时，表面张力随之降低，起泡更加容易，此时PSP在气液界面上聚集，使蛋白质吸附层厚度增加，从而增强泡沫稳定性[8,10]。

图3 MB废水的表面张力（a）和MB废水的起泡性和稳泡性（b）与PSP浓度的关系

(4)PSP浓度对MB泡沫分离效果的影响

本节通过去除率RMB、富集比EMB、吸附密度Γ和持液率εout评价不同浓度PSP对MB捕收效果的影响，结果如图4所示。从图4（a）可以看出，随着PSP浓度的增加，RMB迅速上升，在PSP浓度为500mg·L-1后稳定在92.3%；
从图4（b）可以看出，EMB首先呈现快速上升趋势，达到峰值后其下降速率越来越慢；
从图4（c）、（d）可以看出，εout和Γ均呈现上升的趋势，εout上升速率逐渐缓慢，而Γ上升速率越来越快。

图4 PSP浓度对RMB(a)、EMB(b)、Г(c)和εout(d)的影响

RMB和Γ增加是由于PSP浓度提高，其表面活性增大，与MB结合的位点增多，气液界面吸附的PSP-MB相应增大[11]。对于EMB来说，首先出现快速上升趋势是因为PSP浓度较低，泡沫稳定性较差，聚并和粗化程度高，泡沫层夹带液回流较快[12-13]，随PSP浓度的增加，泡沫稳定性提高，抑制泡沫层夹带液的回流，大量溶液被带入泡沫中，造成EMB降低。εout增大是随着PSP浓度的升高，增加夹带液的黏度，夹带液的流动减小[13]，使夹带液体积增大。本节综合考虑RMB和EMB，选择500mg·L-1作为合适的PSP浓度进行后续的实验。

(5)pH值对PSP泡沫分离MB效果的影响

据文献报道蛋白质分子的带电性是影响其在气-液界面吸附和聚集的关键因素，而蛋白质的带电性受pH影响[12]，因此本节研究MB废水的pH值对MB分离效果的影响，结果如图5所示。

图5 pH对RMB(a)、EMB(b)、Г(c)和εout(d)的影响

从图5（a）、（b）可以看出RMB、EMB随pH值的增加而升高，RMB呈现出先增长、在pH值9.0后维持稳定的趋势。从图5（c）、（d）可以看出Γ、εout随pH值的增加而降低，二者随pH值的增加，Γ降低速率越来越慢，εout呈相反趋势。PSP的PI（等电点）为4.9，当溶液pH＞4.9时，PSP表面带负电荷；
当溶液pH＜4.9时，PSP表面带正电荷[14]。MB作为碱性阳离子染料表面带正电荷，在pH较低时，PSP表面带正电荷，PSP与MB之间相互排斥，随着溶液pH值增大，PSP与MB通过静电作用结合，所以RMB增加。此外EMB快速增加，εout和Γ呈现相反下降趋势的原因是随pH的增加，PSP表面所带电荷增加，蛋白质分子间静电斥力增强，从而降低了PSP在气液界面上的吸附，造成起泡性与稳泡性降低，消泡液体积相应减少[12]。

本节通过评估RMB、EMB、Γ和εout，选择10.0作为合适的泡沫分离MB的pH值。

本文以去除水溶液中的MB为目的，从农产品PS中分离提取得到PSP，创新性地将其作为一种用于浮选MB的起泡剂和捕收剂。紫苏籽蛋白提取结果表明，在pH值9.0、液料比500:1mL/g、提取时间8min、搅拌速度350rpm的条件下紫苏籽蛋白提取率为42.1%。泡沫分离实验结果表明在PSP浓度500mg·L-1、pH值10.0、Cr低至5.5×10-1mg·L-1、RMB为94.6%、EMB为78.8。本文提出了一种绿色、高效的泡沫浮选工艺来处理MB废水，为以PSP作为起泡剂和捕收剂处理染料废水中MB提供了基础数据。

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