L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠学习记忆和自发活动的影响

雒 磊，吴张良，李霁宇，王 阳，胡慧娟，张继业，胡 浩，李 帆*

1.西安交通大学第一附属医院，西安 710061；
2.陕西省西咸新区市场监督管理局沣东新城分局，西安 710116；
3.河南希百康健康产业有限公司，济源 454650；
4.西安交通大学医学部，西安 710061

硒是人体必需的微量元素之一[1]。研究表明，硒具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、预防心血管疾病、解重金属中毒等作用[2-4]。人体缺硒可引起某些重要器官的功能障碍，导致诸多严重疾病的发生[5-7]。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-selenium-methylselenocysteine, L-SeMC)是一种新型硒源类的食品营养强化剂，L-SeMC特殊的甲基化结构使其直接分解生成甲基化硒，并进入甲基硒代谢池，且具有在人体内毒性低、生物利用率高、体内代谢机制清晰等特点[8]。酒精作为外源性的化学物质，进入机体后可作用于肝脏、心脏、大脑等重要器官，而硒的摄入对酒精引起的肝脏、心脏、大脑等器官损伤具有保护作用[9-10]。然而L-SeMC对酒精致中枢兴奋作用的影响尚未见报道，本研究通过观察L-SeMC对低剂量酒精致中枢兴奋的作用，探讨其对小鼠学习记忆和自发活动的影响。

1.1 仪器

实验所用自主活动仪(ZZ-6)、跳台实验系统(SDT-8)以及避暗实验系统(PAT-8)，均由成都泰盟软件有限公司生产。酶标仪(Multiskan FC)，由赛默飞世尔科技有限公司生产。

1.2 试药

L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-SeMC)，白色粉末，质量分数>99%(HPLC)，批号210801，购自河南希百康健康产业有限公司，用蒸馏水配制成不同质量浓度。56度红星二锅头酒，批号SC11511160310087，北京红星股份有限公司生产。ALT、AST、MDA和SOD试剂检测盒，均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验动物

昆明小鼠，SPF级，雄性，体质量18～22 g，动物许可证号为SCXK(陕)2018-001，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。在温度为25 ℃±2 ℃、相对湿度为50%～ 70 %的条件下饲养，12 h明暗交替。

2.1 中枢兴奋作用酒精剂量探索

以往研究多为酒精中毒对机体或动物的影响，而酒精引起中枢兴奋作用的剂量参考较少。结合本课题组前期研究以及初步预实验剂量摸索，最终设定了0.8 、1.3、1.5、1.6 μg·kg-14个酒精剂量组，通过自发活动检测，以寻找引起小鼠中枢兴奋作用酒精的合适剂量。

2.2 动物分组及处理

实验动物随机分为对照组、酒精组、L-SeMC低剂量组、L-SeMC中剂量组、L-SeMC高剂量组。各组动物禁食12 h，对照组与酒精组小鼠灌胃给予蒸馏水，其余3组小鼠分别给予L-SeMC 10.4、13.0、39.0 μg·kg-1。30 min后，对照组灌胃给予蒸馏水，其余组灌胃给予酒精1.5 g·kg-1，给药容积均为0.01 mL·g-1。15 min后，进行自发活动检测、跳台实验和避暗实验。

2.3 自发活动检测

清理擦拭自主活动仪各个通道，将小鼠放置在通道内适应1 min后开始检测，记录5 min内小鼠在水平方向的活动次数和垂直方向的站立次数。

2.4 跳台实验

将小鼠置于跳台箱内，让小鼠在箱内自由活动2 min适应环境，再通电(28 V)对小鼠进行训练5 min，小鼠被电击会跳至安全台上躲避电击，并形成相关记忆。24 h后进行正式实验，将小鼠置于跳台箱安全台上，以小鼠初次离开安全台的时间为潜伏期，5 min内离开跳台的次数为错误次数。

2.5 避暗实验

将小鼠置于避暗箱内，让小鼠在明、暗室自由活动2 min适应环境，再将暗室通电(28 V)对小鼠进行训练5 min，小鼠被电击后会从暗室躲避回到明室，形成相关记忆。24 h后进行正式实验，将小鼠置于明室后，以小鼠初次进入暗室的时间为潜伏期，5 min内进入暗室的次数为错误次数。

2.6 生化指标检测

行为学实验结束后，处死动物，取动物全血和肝脏组织。血液以6 000 r·min-1离心5 min，分离出血清，取血清100 μL，按试剂盒要求，检测血清中ALT和AST的水平。取肝脏组织称定质量，按每0.1 g组织1 mL提取液的比例进行研磨，提取组织蛋白，以12 000 r·min-1离心10 min，分离上清液，按试剂盒要求，取100 μL检测肝脏组织中MDA含量。对蛋白上清液进行蛋白质量浓度检测，取18 μL蛋白上清液，按试剂盒要求检测SOD的活性。

2.7 统计学方法

3.1 酒精对中枢兴奋小鼠自发活动的影响

与空白对照组比较，0.8 g·kg-1酒精摄入对小鼠5 min活动次数和站立次数无显著影响(P>0.05)。而1.3、1.5、1.6 g·kg-1酒精摄入15 min后，小鼠5 min活动次数均明显增多(P<0.01)，且1.5 g·kg-1酒精摄入5 min站立次数也明显增加(P<0.05)。上述结果提示，1.5 g·kg-1酒精是较为合适的引起小鼠中枢兴奋的剂量。见表1。

表1 不同剂量酒精对中枢兴奋小鼠自发活动的影响

3.2 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠自发活动的影响

与空白对照组比较，酒精组小鼠灌胃给予1.5 g·kg-1酒精15 min后，5 min活动次数明显增多(P<0.01)，但5 min站立次数无明显变化(P>0.05)。与酒精组比较，提前30 min灌胃给予不同剂量L-SeMC后再给予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC均可显著减少小鼠5 min活动次数(P<0.05，P<0.01)，5 min站立次数也明显减少(P<0.05，P<0.01)。结果提示，L-SeMC对酒精致小鼠中枢兴奋自发活动有明显抑制作用。见表2。

表2 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠自发活动的影响

3.3 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠学习记忆的影响(跳台法)

与空白对照组比较，小鼠灌胃1.5 g·kg-1酒精15 min后，跳台实验中小鼠潜伏期缩短，错误次数增加，但差异均无统计学意义(P>0.05)。与酒精组比较，提前30 min灌胃给予不同剂量L-SeMC后再给予酒精，10.4 μg·kg-1L-SeMC可显著延长潜伏期(P<0.05)，13.0 μg·kg-1L-SeMC可显著延长潜伏期(P<0.05)，减少错误次数(P<0.05)，而39.0 μg·kg-1L-SeMC对潜伏期和错误次数无明显影响(P>0.05)。结果表明，10.4、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中枢兴奋对学习记忆功能的影响。见表3。

表3 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠学习记忆的影响(跳台法)

3.4 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠学习记忆的影响(避暗法)

与空白对照组比较，灌胃给予1.5 g·kg-1酒精15 min后，避暗实验中小鼠潜伏期显著缩短(P<0.05)，错误次数增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。与酒精组比较，提前30 min灌胃给予不同剂量L-SeMC后再给予酒精，10.4 μg·kg-1L-SeMC可显著延长潜伏期(P<0.05)，减少错误次数(P<0.05)。而13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC对潜伏期和错误次数无明显影响(P>0.05)。结果表明，10.4 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中枢兴奋对学习记忆功能的影响。见表4。

表4 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠学习记忆的影响(避暗法)

3.5 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠肝功能的影响

与空白对照组比较，给予1.5 g·kg-1酒精15 min后，血清ALT、AST水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。与酒精组比较，提前30 min灌胃给予不同剂量L-SeMC后再给予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可不同程度降低血清ALT、AST水平(P<0.05，P<0.01)。结果表明，3个剂量L-SeMC均可改善酒精致中枢兴奋小鼠的肝功能。见表5。

表5 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠肝功能的影响

3.6 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠肝脏氧化损伤的影响

与空白对照组比较，酒精组小鼠灌胃给予1.5 g·kg-1酒精15 min后，肝脏组织MDA含量增加(P<0.01)，SOD活性减弱(P<0.01)。与酒精组比较，提前30 min灌胃给予不同剂量L-SeMC后再给予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可显著降低肝脏组织MDA含量(P<0.01)，增强SOD活性(P<0.01)。结果表明，3个剂量L-SeMC均可显著改善酒精致中枢兴奋小鼠肝脏的氧化损伤。见表6。

表6 L-SeMC对酒精致中枢兴奋小鼠肝脏氧化损伤的影响

硒是人体所需的重要微量元素，我国已批准的硒制品补剂主要有无机硒和有机硒。无机硒主要包括亚硒酸钠、硒酸钠等，有机硒主要包括富硒酵母、硒化卡拉胶、硒蛋白和富硒食用菌粉等[11]。无机硒需进行肝脏转化才可被机体吸收，且毒性大，易引起中毒，实际应用受到严格限制。而有机硒如富硒酵母、硒蛋白和富硒食用菌粉等产品中硒含量不是固定的，且硒的有效补充剂量与中毒剂量较接近，因此这些有机硒的食用也存在一定的安全风险[12]。L-SeMC具有毒性低、生物利用率高、结构明确、人体内代谢机理清晰等特点，是新型的硒源供体，从安全性而言，更适用于在药食类制品中针对相关疾病发挥作用。

硒对诸多酒精诱导的疾病有重要的治疗作用，特别是对酒精引起的神经系统疾病有保护作用[13]。大量研究表明，过量酒精摄入可造成中枢神经系统功能紊乱、学习记忆能力下降，主要是因为酒精能迅速透过血脑屏障进入脑组织，对神经细胞产生毒害作用，同时还可改变神经细胞膜及突触膜流动性，干扰神经细胞递质合成、释放和回摄，引起细胞和突触功能障碍[14-15]。酒精的代谢主要依赖于肝脏的乙醇脱氢酶等关键酶，在其作用下酒精最终转化为乙酸，进入三羧酸循环，该途径可代谢肝脏中80%的酒精，发挥重要的解酒作用，因此提高乙醇脱氢酶活性可加速酒精的体内代谢，在一定程度上可缓解酒精引起的疾病症状[16-17]。研究报道，复方枳椇子制剂和紫苏籽肽复合硒可提高乙醇脱氢酶活力，提高解酒功能[18]。本研究中L-SeMC提供的甲基硒可快速发挥硒的生物学作用，降低酒精引起的中枢神经系统兴奋性，可能与其改善酒精致中枢兴奋小鼠的肝功能、加速酒精代谢有关。此外，L-SeMC在加速酒精代谢的同时，也可能直接通过其抗氧化作用保护脑组织。比如硒可通过增加谷胱甘肽过氧化物酶抑制脂质过氧化，进而减轻ROS系统带来的氧化损伤，这可能与L-SeMC改善受损的学习记忆能力有关[19-20]。本研究中L-SeMC可明显改善酒精致中枢兴奋小鼠肝脏的氧化损伤，发挥潜在护肝作用，加速酒精代谢，从而改善学习记忆。L-SeMC改善学习记忆能力与其剂量关系密切，本研究中10.4 、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中枢兴奋对学习记忆功能的降低，10.4 μg·kg-1对应L-SeMC的人体每日推荐剂量为80 μg，13.0 μg·kg-1对应L-SeMC的国标建议人体每日最大用量为100 μg。而3倍于人体每日最大用量的超大剂量L-SeMC 39.0 μg·kg-1对酒精致中枢兴奋引起的学习记忆功能降低无明显影响。以上结果提示，L-SeMC在一定范围内才能发挥保护作用。此外，10.4 、13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC可显著抑制酒精引起的小鼠中枢兴奋自发活动，这说明酒精引起学习记忆能力下降可能与其对中枢神经系统兴奋状态关系不甚密切，而与酒精对大脑的直接作用有关。

综上所述，L-SeMC作为一种新的硒供体，在一定的剂量范围内可改善酒精致中枢兴奋对学习记忆功能的降低，抑制中枢兴奋自发活动，其机制可能与改善酒精致中枢兴奋小鼠的肝功能和肝脏氧化损伤有关，这为L-SeMC的应用和推广提供了新的参考依据。

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