谷子α-淀粉酶家族基因的全基因组鉴定与表达分析

马荣博，杨宇琭，张丽玲，韩渊怀

（山西农业大学 农学院，山西 晋中 030801）

谷子（Setaria italica）为禾本科（Gramineae）、黍亚科（Panicoideae）、狗尾草属（Setaria）一年生作物，学名粟，于11 500年前在中国驯化，是世界上最古老的栽培农作物之一［1-2］。谷子现广泛分布于亚欧大陆的温带和热带地区，主要种植于亚州东南部、非洲中部和中亚等地区［3］。谷子在我国主要分布于我国北方各省，为传统特色作物［4］。

α-淀粉酶（α-amylases， E.C 3.2.1.1）属于糖基水解酶家族13，是一种内切酶，可随机切割直链淀粉和支链淀粉的α-1，4-糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖和少量大分子极限糊精［5］。目前，拟南芥中鉴定α-淀粉酶基因3个，水稻9个，甘薯中α-淀粉酶基因6个。α-淀粉酶参与植物体内的多种生命活动。

在水稻中，α-淀粉酶同工酶对种子成熟过程中贮藏淀粉颗粒的形成至关重要，并在种子萌发过程中激发贮藏淀粉滋养发育中的幼苗，直接影响植物的生长和田间产量［6］。在低温胁迫下，硒元素和水杨酸诱导均能显著提高种子萌发率和幼苗生长性状，并通过提高α-淀粉酶活性和可溶性总糖含量提高淀粉降解能力［7］。甘薯在低温胁迫时，部分α-淀粉酶基因表达量上调，说明其在应对低温胁迫环境中发挥作用［5］。

α-淀粉酶在淀粉降解及植物体内生命活动中具有重要作用，但关于其在谷子基因组中的报道较少。本研究以“xiaomi”基因组为参考［8］，从中鉴定α-淀粉酶基因家族序列，探究其基因结构等信息，利用转录组测序数据分析这些基因在晋谷21中不同时期的表达量，为研究谷子α-淀粉酶在植物生命周期中发挥的作用提供参考。

1.1 谷子α⁃淀粉酶基因家族成员鉴定，染色体定位及蛋白理化性质分析

于谷子多组学数据库（http：//sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm）下载xiaomi基因组、蛋白序列文件和基因注释文件。从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取的拟南芥和水稻的α-淀粉酶蛋白序列于Tbtools进行BLASTP，设置阈值为1e−5，初步得倒谷子α-淀粉酶基因家族候选基因；
于Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载催化结构域（PF00128）和 Alpha-amyl_C2结构域（PF07821），使用HMMER软件在谷子中筛选属于α-淀粉酶成员，结合2种方法筛确定谷子α-淀粉酶基因家族的候选基因。利用基因注释文件确定SiAmys基因在染色体上的位置，于TB⁃tools中进行可视化。将谷子α-淀粉酶基因家族成员的蛋白序列提交于Expasy在线网站（https：//web.expasy.org/protparam/）进行理化性质分析。

1.2 植物α⁃淀粉酶基因家族的系统发育分析

在NCBI数据库下载拟南芥和玉米的α-淀粉酶蛋白序列，水稻数据库（http：//rice.plantbiolo⁃gy.msu.edu/index.shtml）下载水稻α-淀粉酶序列，与鉴定到的SiAMYs蛋白序列合并在MEGA11.0软件中比对并采用邻接法（Neighbor–joining， NJ；

bootstrap=1000）构建系统 发 育 树。在Evolview（https：//www.evolge⁃nius.info/evolview）网站对进化树进行可视化和优化。根据其系统发育关系SiAMYs被分为3个亚族，其所在亚族及基因ID顺序对其命名（表1）。

1.3 谷子α⁃淀粉酶基因家族成员保守基序及基因结构分析

利用MEME在线网站（http：//meme-suite.org/tools/meme）预测谷子α-淀粉酶基因家族成员中蛋白序列中的保守基序，参数设置为：the num⁃ber of repetition=any， the maximum number of motifs=10，并在TBtools中对SiAMYs基因结构进行分析及保守基序可视化。

1.4 谷子α⁃淀粉酶基因家族成员表达模式分析

从谷子多组学数据库获取SiAmys在晋谷21的不同组织、发育时期中的表达量，用R程序pheatmap包绘制热图，用“欧式距离”法进行聚类。

2.1 谷子α⁃淀粉酶基因家族成员鉴定与染色体定位

通过序列比对在谷子中鉴定得到10个α-淀粉酶基因家族成员，均具有α-淀粉酶的功能结构域特征，此外发现Si8g17840虽未通过序列比对得到但也具有α-淀粉酶的功能结构域特征，因此认为Si8g17840为谷子种特有的α-淀粉酶家族成员（表1）。基因染色体定位结果显示（图1），谷子α-淀粉酶基因家族成员除第9条染色体外，在其它染色体上均有分布。其中SiAmy3C、SiAmy3D和SiA⁃my3E在染色体上紧密排列形成基因簇，基因之间可能存在潜在复制关系，经分析发现SiAmy3D和SiAmy3E之间为串联复制事件。

图1 谷子α-淀粉酶基因家族的染色体分布Fig.1 Chromosome distribution of α-amylase gene family in foxtail millet

表1 谷子11个α⁃淀粉酶基因家族成员的详细信息Table 1 Detailed information for 11 α⁃amylase genes in foxtail millet

对谷子α-淀粉酶基因家族成员蛋白的理化性质进行分析（表2），发现11个成员的蛋白氨基酸数目在415~882 aa之间，其中SiAmy3B序列最长，分子量为98.42 kDa。SiAmy3F的不稳定系数为47.68，超过40，为不稳定蛋白，其可能包含更多的不稳定二肽结构，其它成员均为稳定性蛋白。所有成员的亲水性均为负数，表明其均为亲水性蛋白。

表2 谷子α⁃淀粉酶基因家族成员的蛋白理化性质Table 2 Characterizations of α⁃amylase proteins in foxtail millet

2.2 植物α⁃淀粉基因家族系统发育树分析

为了分析谷子与拟南芥、水稻和玉米的α-淀粉酶之间的进化关系，利用Mega11软件的NJ法构建系统进化树（图2）。AMY基因基因家族成员分为3个亚家族，其中，谷子在第Ⅰ亚家族中仅有SiAmy1A一个成员；
SiAmy2A，SiAmy2B 及 SiA⁃my2C属于第II亚家族成员；
第Ⅲ亚家族所包含的SiAMY成员最多，且双子叶植物拟南芥仅存在于第Ⅲ亚家族。

图2 谷子、拟南芥、水稻和玉米α-淀粉酶家族基因的比较系统进化树Fig.2 Comparative phylogenetic tree of amylase family of foxtail millet， Arabidopsis thaliana， rice， maize

2.3 谷子α⁃淀粉酶基因家族保守基序分析及基因结构分析

谷子α-淀粉酶基因家族成员的蛋白序列具有10个motif，长度从21~50个氨基酸不等（表3），由于SiAmy3B、SiAmy3F和SiAmy3G缺少motif 9，因此除motif 9外，其余的motif高度保守（图3A）。对SiAMY家族成员的基因结构进行分析（图3B），发现，大部分基因都包含编码区（CDS区域）和非编码区（UTR），但各基因的外显子数量差异较大，少的仅3个，多的达13个，有9个基因的外显子为3~4个。

表3 谷子α⁃淀粉酶的保守基序Table 3 Conserved motifs of amylase in foxtail millets

图3 谷子α-淀粉酶家族保守基序及基因结构Fig.3 Conserved motif of the α-amylase family of foxtail millets

2.4 谷子α⁃淀粉酶基因家族时空表达模式表达分析

图4为谷子α-淀粉酶基因家族成员在晋谷21不同时期不同组织中的表达热图，由于基因表达量绝对值差异过大，因此对其取对数且均一化后进行作图。由图4可见，SiAmys的时空表达出现分化，在不同的组织不同的时期中发挥的功能。SiAmy1A、SiAmy2C、SiAmy3A与SiAmy3B具有相似的表达模式，均在种子成熟后30 d和60 d中高表达，同时除SiAmy3B外，其余3个基因在种子萌发中的表达量也相对较高，因此这些基因可能在种子成熟与萌发中发挥重要作用；
SiAmy2B与SiAmy3G在灌浆期根部的表达量比较高；
SiA⁃my3C、SiAmy3D与SiAmy3E主要在未成熟的种子（S1-S4）时期表达，可能在种子发育中起重要作用；
SiAmy2A仅在种子萌发期表达量高，可能为调控种子萌发的重要基因。

图4 谷子α-淀粉酶基因家族成员在晋谷21不同组织、不同时期的表达Fig.4 Expression of amylase gene family members in different tis⁃sues and periods of JG21

α-淀粉酶是谷物整个生长期和生命周期中的关键酶，其在种子成熟和萌发中发挥重要作用。本研究利用模式植物拟南芥的α-淀粉酶序列比对xiaomi全基因组蛋白序列，鉴定得到11个谷子α-淀粉酶基因。α-淀粉酶家族氨基酸数为415~882，分子量35.87~98.42 kD，除SiAmy3F不稳定外，其它均为稳定蛋白。所有蛋白均为亲水性蛋白。

Huang等［9］将α-淀粉酶分为2大类，即AmyA和AmyB，AmyA分为Amy1和Amy2。谷物中的α-淀粉酶基因分为3个亚家族，包括Amy1、Amy2和Amy3（AmyB）［10］。谷子、拟南芥、水稻和玉米的进化树结果表明，α-淀粉酶可以划分为3个亚家族。

分析谷子α-淀粉酶的保守基序，发现其较为保守，大部分基因包含相同数目和顺序的motif。谷子α-淀粉酶基因家族的基因结构表明，其外显子数目介于3~13之间，且其中9个基因的外显子为3~4个，这与水稻9个α-淀粉酶基因其外显子为3~11个不等，且多为3、4个的结果一致［6］，与香蕉α-淀粉酶外显子3~13个的结果一致［11］。另外由于基因结构的不同对其基因功能也会造成影响，可能是导致谷子α-淀粉酶基因家族基因表达模式发生分化的原因。

种子萌发和幼苗建立的主要能量来源是胚乳中储存的淀粉的降解。α-淀粉酶是在种子萌发过程中，在胚内源性赤霉素（GA）诱导下合成，且其合成同时发生在糊粉层和上皮层［12］。He等［13］的研究认为，α-淀粉酶（RAmy1A）在水稻种子胚中GA诱导下48 h时达到峰值。在水稻种子成熟过程中，通过光合作用积累在叶鞘中的淀粉在水解酶作用下降解后不断运输到库中［14］。α-淀粉酶基因在未成熟种子中的高表达水平有助于将暂时储存的淀粉转化为糖，快速满足能量和底物需求，尤其在胚成熟早期。在小麦中，α⁃Amy3基因仅在未成熟籽粒中表达［15］。本文鉴定的基因SiAmy2A、Si⁃Amy2B、SiAmy3C、SiAmy3D、SiAmy3E、SiA⁃my3F与SiAmy3G在种子成熟后完全不表达，与其结果基本一致。在9种水稻α-淀粉酶中，大多数仅在发育中的种子胚中表达，并在种子萌发过程中诱导表达。这与本文研究结果一致。11个谷子α-淀粉酶基因中有8个在籽粒成熟和萌发中高表达。SiAmy2C、SiAmy3A与SiAmy3B主要在种子发育成熟后期和萌发时期大量表达，与水稻中OsAmy3A表达模式相似，因此同样可能与种子休眠过程中生命活动相关。而SiAmy2A在种子发育到成熟的过程中没有表达，仅在萌发中具有高的表达量，这与水稻中OsAmy1A表达模式相同，说明该基因可以响应谷子萌发，与淀粉的储存和分解密切相关，对谷子萌发及穗发芽研究具有重要意义。

本文采用基于xiaomi基因组鉴定到11个谷子α-淀粉酶家族基因，根据其系统发育关系可以划分为3个亚家族，且保守。各家族基因间外显子数量差距大，为3~13个之间。11个家族基因中，8个基因主要参与种子萌发和籽粒成熟，2个基因参与根与叶片中淀粉代谢。本研究结果可为谷子α-淀粉酶基因家族的研究奠定了基础。

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