C3,在结核免疫中的作用及研究进展*

刘建新 何树梅 骆思竹

1 西藏民族大学基础医学院 2.生命科学高校重点实验室 陕西咸阳 712082

结核病是一种有着数万年历史的慢性传染病[1]。时至今日，结核病依然给科研人员及医疗人员带来困扰。根据世卫组织关于2020 年结核病的报告，2019 年全世界约有1000 万新的结核病例，其中约140 万人死于结核病，且近几年处于一个稳定的增长水平[2]。抗结核一线和二线药物疗程长，副反应较大[2]。而唯一的疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG Vaccine）普遍认为对儿童的肺结核有较好的预防作用，而对成人肺结核的预防效果较差[3]。近些年来，由于耐药菌株的出现，以及与人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）共同感染，对全球结核病的控制引起了严峻的挑战[4]。虽然全球和我国在抗结核方面取得了巨大的进步，但距联合国提出的2035 年终止结核病的目标差距还很大[5]。因此，加快研究结核病的详细发病机制，诊断方法，疫苗及药物迫在眉睫。补体系统是固有免疫和特异性免疫的重要构成部分，是由30 多种可溶性蛋白和膜结合蛋白组成，在免疫防御中是抗体发挥溶菌、溶细胞作用的必要补充条件[6]。补体级联反应可由经典途径、旁路途径、甘露糖结合凝集素途径这三条途径所激活，最终形成膜攻击复合物(Membrane Attack Complex，MAC),从而介导靶细胞溶解、破裂[7]。C3 是补体系统中的核心成分，位于三条激活途径的交叉位点。已有研究表明，结核分枝杆菌肝素结合血凝素蛋白（Heparin-binding Hemagglutinin Protein,HbhA）可以与人的C3 结合[8]，但具体机制不详。Risalde 等[9]发现牛分枝杆菌IV 疫苗可保护斑马鱼免受海洋分枝杆菌的入侵的机制是通过C3 激活天然免疫应答。所以研究C3 在结核分枝杆菌入侵机体后激活的机制及所起的作用，对于研发新的疫苗和药物有重大的意义。本文将对C3 在结核免疫中的作用及研究进展做一综述。

1.1 C3 在补体系统中位于中心地位

经典途径、甘露糖结合凝集素途径、旁路途径都可以形成C3 转化酶，可裂解C3 为C3a 和C3b，C3a游离在液相中，C3b 与C3 转化酶结合，形成C5 转化酶，C5 转化酶可使C5 分解为C5a 和C5b，C5b 沉积在细胞膜表面，依次和C6、C7、C8、n 个C9 结合形成MAC，MAC 插入靶细胞膜的脂质双分子层中，从而导致靶细胞溶解、破裂从而发挥溶菌、溶病毒及细胞毒作用[10-12]。FI 在辅因子存在的情况下裂解C3b 生成iC3b，在Cr1 存在的情况下，FI 继续裂解iC3b 形成C3dg，最后形成C3d，C3c 在裂解过程中被释放[13]。

1.2 C3 的进化及鉴定

C3 是补体系统中的核心成分，最早出现于7 亿多年前，属于α2-巨球蛋白家族，由C3 基因编码。C3基因在哺乳动物及鱼类的进化史上发生了三次正向选择，由于水生和陆生生态环境的不同，鱼类和哺乳动物的C3 基因有不同的进化发展方式[14]。人的C3 是由19 号染色体上的41kb 的单个C3 基因编码的[15]，由115kDa 的α 链和75kDa 的β 链组成，由一个二硫键连接[16]。

为了验证C3 是否与分枝杆菌结合，并产生免疫应答。Risalde 等通过C3 配体亲和印迹的方法，从结核分枝杆菌中鉴定出一个30kDa 的可以与C3 结合的蛋白并且该蛋白位于结核分枝杆菌的细胞膜上，这个蛋白的氨基酸序列与分枝杆菌的HbhA 蛋白相匹配。但是未证明C3 的哪个部位与HbhA 的赖氨酸-丙氨酸重复序列结合。该蛋白通过与C3 结合，可能与巨噬细胞表面的补体受体CR3 结合，从而启动先天性免疫应答。Mueller-Ortiz 等[17]则在实验中，利用一株HbhA 表达缺失的结核分枝杆菌的突变体感染小鼠，以确定HbhA 是否在C3 介导的结核分枝杆菌粘附或摄取的单核细胞中起作用。结果表明模型组和对照组小鼠的巨噬细胞在于结核分枝杆菌的粘附、吞噬、存活方面无任何差异。对HbhA 突变株进一步研究发现了与C3 结合的结核分枝杆菌另一种结合蛋白HupB。Ferguson 等[18]利用不同浓度的新鲜非免疫性的人血清和人支气管肺泡灌洗液证明了结核分枝杆菌可以与C3裂解产物C3b 或iC3b 共价结合，导致人支气管肺泡液中巨噬细胞的吞噬能力增强，并且证明了经典途径比旁路途径发挥更大的作用。Risalde 等[19]发现用牛分枝杆菌疫苗浸泡斑马鱼，发现浸泡后的斑马鱼对海分枝杆菌的入侵有较好的控制效果。这种保护作用是通过减少海洋分枝杆菌感染、每个肉芽肿中的海分枝杆菌数量和的肉芽肿数量来实现的，并且功能研究表明，牛分枝杆菌IV 疫苗通过斑马鱼肠道、鳃等器官表面的TLR 受体从而激活C3 来介导补体级联反应来启动天然免疫应答。由此可见，C3 在天然免疫应答中发挥着非常重要的作用。Gortazar 等[20]给欧亚野猪注射牛分枝杆菌卡介苗并随后用牛分枝杆菌野生型菌株攻击野猪，发现卡介苗接种后野猪的C3 明显高于对照组，但在分枝杆菌攻击后C3 水平随即显著下降。Beltrán-Beck 等[21]用牛分枝杆菌灭活的疫苗攻击野猪，证明分枝杆菌通过一种未知的机制激活C3 从而诱导先天性免疫和适应性免疫的激活。但Bohlson 等[22]利用C3缺乏的小鼠感染鸟分枝杆菌，却惊奇的发现C3 缺陷小鼠与野生型小鼠相比，细菌负荷和肉芽肿方面却无较大的差异性表现。C3 过表达的小鼠与C3 缺陷的小鼠对鸟分枝杆菌有相同的敏感性。无C3 的情况下与有补体介导的免疫应答比较，小鼠的巨噬细胞吞噬鸟分枝杆菌的能力增强。提示宿主存在其它受体来代偿C3 的缺失去介导与鸟分枝杆菌的结合而引起免疫应答。

已有研究表明，补体系统的其它成分也可与分枝杆菌结合。Carroll 等[23]证明了牛分枝杆菌卡介苗在经典途径中有无抗体存在的条件下都可以与人血清C1q 结合，只是在IgM 或IgG 存在的情况下可与C1q的结合增强2～3 倍。旁路途径的激活无抗体依赖性，H 因子也与之结合。在凝集素途径中，人血清中甘露糖结核凝集素和L 型纤维胶原素可与牛分枝杆菌卡介苗结合，随后激活MASP2，导致补体级联反应的激活，但H 型纤维胶原素不能与之结合。而且同时证明了C3b 沉积在靶细胞膜上。补体受体中已证明结核分枝杆菌与巨噬细胞表面的补体受体CR3[24]、CR4[25]结合，结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后会使巨噬细胞启动天然免疫应答，从而发挥抗结核分枝杆菌的作用。Cabec 等[26]使用了可稳定表达人非吞噬作用的CR3 的仓鼠卵巢细胞研究CR3 介导的由iC3b 包被的调理吞噬作用和非调理吞噬作用，发现在吞噬过程中通过不同的CR3 结合位点发生了不同的吞噬机制。Melo 等[27]利用CD11b 基因敲除小鼠CR3，发现CR3 介导了40%～50%的结核分枝杆菌与巨噬细胞的结合。而且进一步发现结核分枝杆菌在体外巨噬细胞模型和小鼠感染模型中的的存活和复制并没有受到CR3 缺失的影响。这提示巨噬细胞表面有其它受体来介导结核分枝杆菌进入巨噬细胞。Rooyakkers 等同样利用CR3 基因敲除的小鼠，却发现缺少CR3 会导致活菌的摄取减少50%，但对巨噬细胞内活性氧及活性氮中间产物的诱导及干扰素-y 激活的巨噬细胞内的结核分枝杆菌的生长没有影响。Zaffran 等[25]证明了CR4 通过调理素iC3b 参与人单核巨噬细胞对结核分枝杆菌吞噬作用，在没有调理素的作用下，结核分枝杆菌可通过CR4 直接与巨噬细胞进行结合，这种结合可导致巨噬细胞中一个60kDa 蛋白迅速酪氨酸磷酸化。

Kopf 等[29]证明了C3 缺陷的小鼠对初次感染流感病毒的高敏感度。C3 缺陷的小鼠出现病毒清除延迟，肺部病毒滴度增加，肺引流淋巴结中T 辅助细胞的启动减少，CD4+T、CD8+T 细胞向肺内募集的功能严重受损。C3a 不仅对中性粒细胞有趋化作用，C3a 还可以与树突状细胞（DC）直接结合，调节小鼠骨髓DC的激活和功能。C3aR 在多种髓系细胞和非髓系细胞上都有表达。C3aR 在DC 上也有表达，在缺乏C3aR 的小鼠中，DC 表型活化程度降低，抗原摄取和提呈能力下降，并且体内外刺激同种异体T 细胞反应能力降低。C3aR 同时也在T 细胞上表达，并上调T 细胞的活化[30]。C3b 与外来病原体表面结合可形成复合物，被APC 上补体受体所摄取，然后通过主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）II 类分子传递给T 细胞，从而激活适应性免疫应答[31]。B 细胞表达CR2（CD21）,可与结合了C3d 和iC3b 的抗原表面相互作用，诱导B 细胞受体信号增加[32]。

以上重点总结了C3 在结核免疫中的作用及研究进展以及部分补体成分与分枝杆菌的结合及C3 及其裂解片段与部分免疫细胞之间的相互作用。C3 在结核分枝杆菌侵袭机体时发挥了重要作用，但关于C3 及其它补体成分在结核分枝杆菌侵入机体后的详细机制尚不清楚，如结核分枝杆菌是如何逃避补体系统的，补体的三条途径是否在结核分枝杆菌入侵机体的过程中都发挥了作用，如果发挥了作用，哪条补体通路最先发挥作用，又是哪一条通路的贡献最大，补体系统每个成分都发挥着怎样的作用，补体系统和其它免疫细胞之间是如何的相互作用的。虽然已经研究证明C3可以与结核分枝杆菌的HbhA 和HupB 蛋白可以结合，但详细的结合机制尚不清楚。还有人用C3a 抑制剂用来减少局部的炎症反应。但目前关于补体系统在结核病的发病机制中的鲜有报道。研究C3 在结核免疫中的作用会为我们研究补体系统在结核病的发病机制中所起的作用填补许多空白，为探究结核分枝杆菌的详细发病机制及药物和疫苗的研发提供可鉴之处。

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