防风根腐病拮抗真菌的筛选鉴定及生防作用研究

韩忠明，孙 卓，王 妍，张福军，马峰敏，罗秋菊，杨利民*

（1.吉林农业大学中药材学院/省部共建生态恢复和生态系统管理国家重点实验室培育基地，长春 130118；

2.集安市太王镇林业工作站，集安 134200；
3.吉林查干湖国家级自然保护区管理局，松原 131111）

防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schisck.为伞形科防风属植物，以未抽花茎植株的干燥根入药。味辛、微甘、性温，具有止痉、祛风解表、胜湿止痛的功效[1]。防风作为新型冠状病毒诊疗方案推荐中成药“防风通圣丸”等中成药的重要原料，同时也是我国传统的出口药材，具有广阔的应用前景和可观的经济价值。随着防风用量不断增加，并出口韩国、日本及东南亚各国，导致野生资源锐减，价格逐年上涨，为此，防风的栽培面积逐渐扩大，主要集中在东北和内蒙古等地区，其中吉林省白城地区防风的栽培面积占全国面积的60%以上，但随着栽培面积的不断扩大，防风根腐病逐年加重，发病范围逐渐扩大，造成防风大面积减产。木贼镰刀菌是引起防风根腐病的主要病原菌，通过入侵根部成为优势种，并破坏维管束组织来减少根部内生真菌的联合[2]。防风根腐病发病初期根部产生褐色腐烂病斑，发病后期，染病根茎部有黑褐色、水渍状、长条形的腐烂病斑。地上部分叶片变黄、细小，最后整株枯死[3]，已成为严重危害防风根茎类中药材的主要病害之一。目前，对于防风根腐病主要采用恶霉灵、多菌灵、50%托布津等[3]化学农药进行防治。然而长期使用化学农药不仅容易导致农药残留[4]，还会形成病害抗药性[5]、破坏生态平衡[6]、造成环境污染并且对人类身体健康构成威胁[7]。而生物防治具有绿色安全无污染等特点，为此，生防菌的开发与应用成为了植物病害合理化防控的研究热点[8]。

药用植物根际微生物作为宝贵的微生物资源，在植物病害生物防治方面越来越引起研究者们的关注。根际微生物种类丰富，可通过竞争、寄生、拮抗等作用方式抑制病原菌生长，提高植物防御酶活性、分泌促生长物质等促进植物生长。近年来，利用根际微生物防治中药材土传病害研究已取得部分进展，杜用玺[9]从丹参根际土壤中分离出对丹参根腐病具有拮抗效果菌株SMRA-220，且可产生IAA，促进丹参生物量的积累。高芬等[10]从黄芪根围土中分离出一株对黄芪根腐病具有较强拮抗效果的萎缩芽胞杆菌。目前，从防风分离得到病原菌主要有防风壳状孢、独活白粉菌和旱芹叶点霉等[11]，而关于防风根际土壤生防菌的分离和鉴定鲜有报道，因此从防风根际土壤中分离筛选对根腐病具有较高防治效果的生防菌株，并用于防治防风根腐病具有重要的理论和意义和实际指导意义。本研究以防风根际土壤为研究材料，分离获得一株对木贼镰刀菌具有较强抑菌活性的拮抗菌株，并对其进行了形态、显微特征和ITS基因序列鉴定，并对此拮抗真菌的抑菌机理及在土壤中的定殖和对防风的防病效果进行了初步研究。为防治防风根腐病、提高防风产量具有指导意义，同时为微生物农药的开发利用提供依据。

1.1 材料

防风根际土壤采集于2020年7月从吉林农业大学药用植物园（43°48′23″N，125°24′57″） 采集人工栽培健康的1年生防风植株的根际土壤，采用五点取样法结合抖落法，采集健康防风植株根际土壤（距离主根及须根根轴表面0～3 mm土壤），装于无菌自封袋中，放入4 ℃ 冰箱内保存，备用。

木贼镰刀菌Fusarium equiseti、尖孢镰刀菌F.oxysporum、腐皮镰刀菌F.solani、细极链格孢Alternaria tenuissima、鹅掌楸链格孢A.liriodendra、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、恶疫霉Phytophthora cactorum、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum均由吉林农业大学植物病理实验室提供。

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，琼脂17.0 g，去离子水1000 mL；
马铃薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，去离子水1000 mL。

供试药剂70%代森锰锌可湿性粉剂（四川润尔科技有限公司）、枯草芽胞杆菌可湿性粉剂（山东鲁抗生物农药有限责任公司）、哈茨木霉可湿性粉剂（山东绿陇生物科技有限公司）、97%利福平（上海麦克林生化科技有限公司）、DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa宝日医生物技术有限公司）。

Nikon eclipse 50i 三目显微镜（尼康仪器有限公司）、THZ-702B全温度振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）、PTC-300光照培养箱（上海三腾仪器有限公司）、DYY-8C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、Applied Biosystems ProFlex PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）、Multifug1 X1R高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 拮抗真菌的分离纯化 采用稀释培养法分离土壤中的真菌，将防风根际土风干后过 20目筛，称取10 g放入装有90 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中充分震荡摇匀，依次以10倍梯度稀释得到各浓度土壤稀释液。分别取10-3、10-4和10-5的稀释液200 μL涂布于PDA培养基平板中，在25 ℃倒置暗培养3 d，挑取培养基上形态各异的单菌落进行分离纯化，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 拮抗菌株的筛选 以木贼镰刀菌为靶标菌，对分离出的真菌采用两点对峙法进行筛选。用打孔器分别在纯化好的根际真菌与病原菌边缘打孔，得到直径为8 mm的菌饼。将病原菌菌饼接入直径为90 mm的PDA培养皿中央，在距病原菌菌饼25 mm的两个对称点接入根际真菌菌饼，以只接木贼镰刀菌为对照，重复3次。置于25 ℃黑暗下倒置培养7 d，计算每株菌株的抑菌率。抑菌率（%）=[（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%

1.2.3 拮抗菌株的鉴定 选取已纯化的待测菌株用打孔器打取8 mm菌饼接种于PDA培养基中央，25 ℃暗培养 14 d，观察菌落形态、菌落直径、孢子大小、形态和着生方式的特征等，并参照《真菌鉴定手册》[12]对于病原菌进行形态学的鉴定。

采用TaKaRa DNA提取试剂盒提取菌株MR-47的基因组总DNA。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对菌株 MR-47 进行 PCR 扩增。反应体系：Master Mix 12.5 μL、ITS1 1 μL、ITS4 1 μL、rDNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL，扩增程序为 94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃ 5 min[13]。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增产物交由上海生工进行纯化测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对。通过MEGA 7.0软件采用neighbor-joining法构建菌株MR-47的系统发育树。

1.2.4 拮抗菌株发酵液对木贼镰刀菌菌丝生长的影响 将待测菌株与木贼镰刀菌在对峙培养下，挑取两菌落相交部位菌丝制成玻片，于显微镜下观察待测菌株与木贼镰刀菌相互作用后病原菌菌丝形态特征。

1.2.5 拮抗菌株的抑菌谱 以立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉、灰葡萄孢等 10株病原真菌为靶标菌，用平板对峙法对拮抗菌株进行抑菌谱测定，将10种病原菌打取8 mm菌饼分别接种于PDA平板中央，待测菌株接种于距PDA中心25 mm的两个对称点中，培养7 d，计算抑菌率，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

1.2.6 拮抗菌株的定殖 利用抗生素标记法[14]标记待测菌株，相继在含有不同浓度利福平的 PDB培养基中对菌株MR-47进行逐级诱导，使菌株可在含有抗利福平浓度达300 μg/mL的PDB培养基中稳定生长的菌株MRRif-47，经遗传稳定性后保存、备用。收集标记菌株MRRif-47分生孢子（1×108CFU/mL）均匀拌土，每盆土300 g，倒入孢子悬液30 mL，3次重复。拌土结束后第7、14、21、28、35d分离土壤中的菌株MRRif-47。菌株MRRif-47的分离：采用梯度稀释法同1.2.1，取梯度10-4浓度溶液200 μL涂布于含有300 μg/mL利福平的PDA培养皿中，3次重复，25 ℃培养3 d后统计每个培养皿中菌落数量，计算土壤中含菌量（CFU/g）。

1.2.7 菌株MR-47的盆栽防效试验 挑选长势一致的1年生健康防风幼苗40株，每盆1株，采用针刺法于防风茎基部划伤约1 mm伤口，并以灌注方式沿植株茎基接种木贼镰刀菌孢子悬液10 mL（孢子浓度为1×107CFU/mL）。试验共设5个处理组，每组处理8次重复，各处理组独立且完全随机分布，具体为：（1）清水50 mL，对照；
（2）70%代森锰锌800倍液50 mL；
（3）1×107CFU/mL枯草芽胞杆菌可湿性粉剂50 mL；
（4）1×107CFU/mL哈茨木霉可湿性粉剂50 mL；
（5）菌株MR-47孢子悬液1×107CFU/mL接种50 mL。接种30 d后调查防风根腐病发病情况，计算病情指数与防效。

防风根腐病病情分级标准：0级：健株，无病斑；
1级：全株10 %以下的叶片发病；
3级：全株11%～25%的叶片发病；
5级：全株26%～50%的叶片发病；
7级：全株51%～75%的叶片发病；
9级：全株76%以上的叶片发病[15]。病情指数＝∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100，防治效果（%）＝（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用DPS12.01软件进行差异显著性检验，用Duncan"s新复极差法进行多重比较。

2.1 拮抗菌株的分离和筛选

通过稀释涂布法共分离到104株真菌菌株，将分离得到的菌株与木贼镰刀菌做生长对峙实验，筛选出29株对木贼镰刀菌具有抑菌效果的拮抗菌株，菌株 MR-47对木贼镰刀菌有较强抑菌效果，其抑菌率为69.26%（图1）。因此，选定菌株MR-47进行后续研究。

图1 菌株MR-47对木贼镰刀菌的抑菌效果Fig.1 The inhibitory effect of antagonistic strain MR-47 on F.equiseti

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 菌株在PDA中25 ℃暗培养14 d，菌落直径为53～55 mm，菌丝密实、绒毡状、无白边，形成环状轮纹，菌落正面淡粉色；
背面有放射状皱纹、呈橙褐色，有橙黄色分泌物渗入培养基中（图2a）。菌丝无色，产孢瓶体自菌丝侧生，不分枝、细长、近无色，长20～35 μm，基部宽1.5～3 μm，端部变窄，宽1～2.5 μm。分生孢子无色、近球形，直径为3～6 μm（图2-b）。根据菌落及显微形态鉴定该菌株为枝顶孢属。

图2 菌株MR-47菌落及显微形态特征Fig.2 Colony and morphological characteristics of strain MR-47

2.2.2 分子鉴定 菌株MR-47的ITS序列长度为476 bp，GenBank登录号为OK287149.1。将该序列上传至GenBank数据库进行同源性比对，发现菌株MR-47与桃色顶孢霉Acremonium persicinum（KT315412.1）的相似度达99.77%。选择相似性较高的菌株ITS序列构建系统发育树（图3）。结合形态特征及分子生物学鉴定结果最终确定菌株MR-47为桃色顶孢霉Acremonium persicinum。

图3 菌株MR-47基于18S rDNA序列构建的系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree of strain MR-47 based on 18S rDNA sequence

2.3 拮抗菌株对木贼镰刀菌菌丝的影响

在光学显微镜下，对照菌丝光滑顺直、粗细均匀（图4a）；
与MR-47对峙生长的病原菌菌丝形成缢缩（图4b）、膨大、扭曲畸形、粗细不均（图4c）等现象，说明MR-47可通过产生代谢产物抑制病原菌生长。

图4 菌株MR-47对木贼镰刀菌菌丝生长的影响Fig.4 Antibacterial effect of strain MR-47 on hypha growth of F.equiseti

2.4 拮抗菌株的抑菌谱

菌株MR-47对10种病原真菌均具有较强抑菌作用，其中对恶疫霉与毁灭柱孢菌的抑制作用最强，达到70%以上，分别为72.22%与74.07%。对立枯丝核菌的抑菌效果较弱，仅40.74%。表明拮抗菌株MR-47具有较强的广谱抑菌能力（表1）。

表1 菌株MR-47对10种病原真菌抑制效果Table 1 Inhibitory effect of strain MR-47 on 10 pathogenic fungi

2.5 拮抗菌株在土壤中定殖能力

经抗利福平诱导之后，待测菌株MR-47经传代培养10代，仍可在含有300 μg/mL利福平的PDA中稳定生长，标号为MRRif-47。土壤定殖试验周期为35 d，未接种标记菌株的供试土壤经检测，其所含微生物无法在含有300 μg/mL利福平的PDA平板生长，由此说明，该浓度下的抗生素选择培养基可用于MRRif-47菌株的有效回收。如图5所示，土壤中菌株MRRif-47接种第21 d含菌量最低，为5.57×106CFU/g土，而第28 d含菌量最大，达到8.38×106CFU/g土；
随后菌株MRRif-47的土壤含菌量平缓下降，接种后35 d，其土壤含菌量仍可达到6.13×106CFU/g。结果表明，菌株MR-47具有较好土壤定殖能力。

图5 标记菌株MRRif-47在土壤中的定殖量Fig.5 Colonization of MRRif-47 in the soil of S.divaricata

2.6 拮抗菌株盆栽防病效果

菌株MR-47对防风根腐病的盆栽防控效果如表2所示，与对照相比，菌株MR-47、农药代森锰锌、枯草芽胞杆菌及哈茨木霉，对防风根腐病发病率和发病程度均表现出了不同程度的抑制作用。经 MR-47孢子悬液处理的防风根腐病病情指数为16.00，相对防效达75.05 %，相较于代森锰锌（61.54%）、枯草芽胞杆菌（49.99%）及哈慈木霉（51.89%）处理，具有显著差异（P＜0.05）。由此说明，菌株MR-47对防风根腐病具有显著防治效果。

表2 菌株MR-47对盆栽防风根腐病防效Table 2 Control effect of strain MR-47 on root rot of S.divaricata

中药材是农业发展的重要产业之一，目前我国大力支持以中药材为基础的中医药产业协同发展的振兴之路。随着中药材种植业的发展，农药残留问题受到广泛关注[16]。土壤中微生物资源丰富，是拮抗菌筛选的重要来源，本研究从防风根际土中分离出 104株根际真菌，并筛选出一株对木贼镰刀菌抑菌效果达69.26%的菌株MR-47，根据对菌落形态观察、结合ITS序列分析和构建系统发育树，最终鉴定菌株MR-47为桃色顶孢霉A.persicinum。

桃色顶孢霉A.persicinum是一株广泛分布于土壤与海洋中的真菌[17]。目前，关于桃色顶孢霉的研究较少，主要集中于次生代谢产物的研究，并从中分离出多种环肽化合物[18]。如Ikuko等[19]从中分离出一种具有较强杀菌能力的螯合铝离子的环状六肽化合物ASP2397。Mohammadian等[20]研究发现A.persicinum对Zn和Cu具有较强积累能力，可应用于土壤修复。此外，董雪梅等[21]研究发现顶孢霉菌可明显抑制玉米圆斑病菌菌丝生长及孢子萌发。本研究表明，桃色顶孢霉MR-47对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌等常见病原真菌具有较强的拮抗作用，表现了良好的广谱抑菌能力。MR-47与木贼镰刀菌共培养时，病原菌菌丝出现膨大、缢缩、扭曲等畸形现象，严重影响木贼镰刀菌菌丝的正常生长。由此推测，桃色顶孢霉MR-47可能通过产生具有抑菌作用的胞外产物，实现其对防风根腐病致病菌木贼镰刀菌的生长抑制。但桃色顶孢霉 MR-47产生抑菌效应的具体物质尚不明确，仍需开展后续工作挖掘研究。

国内外许多研究表明，生防菌的定殖能力是影响其生防效果的重要因素[22]。因此，生防菌在植物体内和根际土壤中的定殖能力成为评定其是否具有产业化前景的一个重要指标。焦蓉等[23]对生防菌YN201728在烟草内的定殖规律及防病机制的研究中表明，生防菌密度的定殖规律为根表土＞根际土＞根＞茎＞叶，在烟草叶片中内生菌的定殖量与防效呈正相关。目前，本研究对菌株MR-47土壤中的定殖能力进行评价，发现菌株MR-47定殖于土壤中35 d后，在土壤中仍可达到较高活菌数，达到6.13×106CFU/g。对防风根腐病具有较强防治效果，其防效可达 75.05%，对照组枯草芽胞杆菌与哈茨木霉的防效分别为49.99%、51.89%。综上所述，分离筛选自防风根际土壤的桃色顶孢霉 MR-47在防风生态友好型病害防控方面具有开发及应用潜力。

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