不同纯度藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基清除动力学研究

周贵华，梅 邢，程 超

(湖北民族大学 生物与食品工程学院，湖北 恩施 445000)

藻蓝蛋白(phycocyanin)是一种天然色素蛋白[1]，具有抗氧化[2]、抗癌[3]、抗炎[4]、增强免疫力[5]等生物活性.藻蓝蛋白是包含α和β 2个亚基的聚合体，而α和β亚基是由脱辅基蛋白和藻胆素以硫醚键共价连接而成的，藻蓝蛋白的纯度通常以溶液Amax/A280的比值来评估[6].有研究发现藻蓝蛋白的色基丢失或者脱辅基蛋白结构改变会影响藻蓝蛋白的抗氧化活性[7-9]，但尚不明确藻蓝蛋白的色基和脱辅基蛋白对其抗氧化活性哪个影响较大.

抗氧化动力学反映了反应速率与影响因素间的函数关系，可定量表示抗氧化剂抗氧化效果随时间的变化规律，对深入探究抗氧化剂的作用机理有重要意义[10].陈凌等[11]发现干制马齿苋多糖的抗氧化反应接近一级反应动力学方程.李慧卿等[12]发现浸提与蒸馏毛建草精油清除DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazy)反应接近二级反应动力学方程.刘璐等[13]探究不同温度下番茄红素对核桃油抗氧化规律，发现核桃油的氧化速率与温度和番茄红素添加量均有关，其核桃油的Ln K与1/T之间为线性关系，符合阿伦尼乌斯动力学模型.刘晓庚等[14]发现类胡萝卜素清除DPPH的变化规律符合一级反应动力学模型.但目前未见色素蛋白类的抗氧化动力学报道，因此本文以典型的色素蛋白藻蓝蛋白为研究对象，系统测定其清除自由基的反应动力学特征.

目前体外抗氧化活性测定方法主要有：ABTS阳离子自由基法[15]、DPPH法[16]、邻苯三酚自氧化法[17]、氧自由基吸收能力法[18]、铁离子总还原法[19]等.DPPH法由于其亲脂性，在水溶性试样的抗氧化研究中有局限性；
氧自由基吸收能力法耗时相对较长；
铁离子总还原法检测时间很短，不适合同时测定多种试样；
邻苯三酚自氧化体系则存在检测波长、缓冲液组成及pH值等外部因素显著影响检测结果、且检测时间较短等缺陷；
相比之下ABTS阳离子自由基法简单便捷、灵敏度高，是目前常用的抗氧化活性测定方法之一.鉴于此，重点研究5种不同纯度的藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基能力的差异，进而建立抗氧化动力学模型，确定藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基反应的速率常数与藻蓝蛋白的纯度、色基和蛋白质含量的关系，从而为藻蓝蛋白抗氧化活性的相关研究提供新的数据资料.

1.1 材料与试剂

藻蓝蛋白A、B分别购于韵乐生物科技有限公司、化成工业株式会社；
藻蓝蛋白E、F购于安欣禄生物科技有限公司；
藻蓝蛋白C是湖北民族大学食品科学与工程实验室自制；
除藻蓝蛋白C由葛仙米提取，其余4种藻蓝蛋白均源于螺旋藻.过硫酸钾为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；
ABTS为分析纯，购于东京化成工业株式会社.

1.2 实验仪器

主要仪器包括紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，UV-9000S)、酶标仪(帝肯贸易有限公司，Infinite200pro).

1.3 实验方法

1.3.1 5种藻蓝蛋白色基、纯度和蛋白质含量 分别称取5种藻蓝蛋白100 mg，避光用蒸馏水配制成1 mg/mL溶液，在250～750 nm进行光谱扫描，藻蓝蛋白色基和蛋白质含量分别用可见光区最大吸收峰吸光度值Amax和280 nm蛋白质特征吸收峰吸光度值A280表示，纯度为藻蓝蛋白溶液Amax与A280之比(Amax/A280)[20].

1.3.2 ABTS阳离子自由基标准曲线绘制 参照文献[21]，ABTS阳离子自由基工作液配制方法：7 mmol/L的ABTS溶液5 mL与140 mmol/L过硫酸钾溶液88 μL混合均匀后静置12 h.用蒸馏水将工作液配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mmol/L的ABTS阳离子自由基溶液，测定其734 nm吸光度值，将ABTS阳离子自由基浓度作为横坐标，734 nm的吸光度值作为纵坐标绘制标准曲线，拟合得标准曲线方程为y=5.915 2x-0.002 3，R2=0.999 6.

1.3.3 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的反应动力学 按照1.3.1的方法将藻蓝蛋白C配置成0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg/mL的溶液，其余4种藻蓝蛋白配置成1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL的溶液，分别与ABTS阳离子自由基工作液以1∶4比例混合，旋涡振荡混匀后立即用酶标仪在734 nm处按1 次/s的频率测定吸光度值，连续记录其在360 s内的吸光度值Ax，并用蒸馏水为对照组，记录吸光度值A1，按照式(1)计算藻蓝蛋白的清除率，并绘制5种藻蓝蛋白随时间延长对ABTS阳离子自由基清除率反应的曲线[22-23].

(1)

式(1)中：a表示ABTS阳离子自由基清除率(%)；
Ax是样品组的吸光度值；
A1是对照组的吸光度值；
A0=0.70±0.02.

根据藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的时间效应曲线，按式(2)建立反应动力学模型[24-25].

(2)

因此，准一级和准二级反应动力学方程式分别为式(3)和式(4).

ln(1-a)=-k1t，

(3)

(4)

由于St=S0×(1-a)，因此式(4)可以转换成式(5).

(5)

式中：St是tmin时ABTS阳离子自由基浓度(mmol/L)；
S0为0 min时ABTS阳离子自由基浓度(mmol/L)；
A是ABTS阳离子自由基剩余率(%)；
k1为拟一级反应速度常数(min-1)；
k2为拟二级反应速率常数(mmol·L-1·min-1).

表1 5种藻蓝蛋白的紫外扫描图谱及蛋白质、色基和纯度Tab.1 The ultraviolet scanning and chromophore,proteins,purity of five phycocyanins

1.4 统计分析

采用SPSS 21软件对实验数据进行相关性分析，利用Origin 2018软件作图并进行拟合.

2.1 5种藻蓝蛋白的紫外-可见光谱分析

5种藻蓝蛋白色基、蛋白质的特征吸收峰及其紫外扫描光谱结果如表1所示.由表1中紫外扫描图谱可知，藻蓝蛋白C的可见光区的最大吸收峰为620 nm，其他4种藻蓝蛋白溶液的可见光区的最大吸收峰在614～618 nm，产生差异的主要原因可能是样品C源于蓝藻葛仙米，其他4种源于蓝藻螺旋藻.样品C除了620 nm波长附近有吸收峰外，在559 nm左右还有一个微弱吸收峰，结合文献[26]判断藻蓝蛋白C可能为R-藻蓝蛋白，其他4 种为C-藻蓝蛋白.

藻蓝蛋白色基含量以可见光区最大吸收波长的吸光度值表示(Amax)，蛋白质含量以280 nm吸光度值表示(A280).由表1可知：5种藻蓝蛋白纯度为A>B>F>E>C，蛋白质含量即A280：C>E>F>B>A，色基含量即Amax：E>A>F>B>C.

2.2 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的剂量时间效应关系

5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的剂量时间效应曲线如图1所示.由图1可以看出，5种藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基清除能力随反应时间的延长均增强，但不同质量浓度的不同藻蓝蛋白的时间剂量效应关系存在一定的差异.由于藻蓝蛋白C对ABTS阳离子自由基的清除效果远远优于其他4种，因此实验过程中藻蓝蛋白A、B、E、F选择0.2～1.0 mg/mL的质量浓度，而藻蓝蛋白C选择0.1～0.5 mg/mL的质量浓度.在此质量浓度范围内，5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基具有剂量效应关系，其中藻蓝蛋白A最高清除率达82.3%，藻蓝蛋白E和F的清除效果劣于其他3种藻蓝蛋白.另外，低质量浓度的藻蓝蛋白溶液对ABTS阳离子自由基清除反应约在60～120 s内达到平衡，随着质量浓度增加，藻蓝蛋白清除速度达到平衡的时间逐渐延长.可能是因为藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基无选择性，当藻蓝蛋白在低质量浓度时，含有的抗氧化基团有限，但ABTS阳离子自由基很充足，ABTS阳离子自由基与藻蓝蛋白抗氧化基团快速结合达到平衡；
相反，当藻蓝蛋白质量浓度较高时，ABTS阳离子自由基和抗氧化基团均很充足，所以结合需要一定的时间，这也可能是1.0 mg/mL的藻蓝蛋白B清除ABTS自由基初始清除率有轻微下降的原因.

图1 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的剂量时间效应关系Fig.1 Dose-time-effect relationship for the scavenging on ABTS+·of five phycocyanins

图2 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的准一级反应动力学方程Fig.2 Pseudo first order reaction kinetic equation for the scavenging on ABTS+·of five phycocyanins

2.3 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的反应动力学

为探讨藻蓝蛋白抗氧化能力随质量浓度和反应时间的变化规律，根据式(3)建立准一级动力学模型，拟合5种不同质量浓度藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的准一级反应动力学方程和相关标准曲线，如图2所示.同理根据式(4)建立准二级反应动力学模型，拟合5种不同质量浓度藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的准二级反应动力学方程和相关标准曲线，如图3所示.

图3 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的准二级反应动力学方程Fig.3 Pseudo second order reaction kinetic equation for the scavenging on ABTS+·of five phycocyanins

表2 5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基动力学拟合方程及相关系数Tab.2 Kinetic fitting equations and correlation coefficients of five phycocyanins scavenging ABTS+·

准一级和准二级反应动力学模型的拟合方程、相关系数及速率常数如表2所示.由表2可知，R2=0.994 1是准一级反应动力学拟合中最高的相关系数，而R2=0.998 1是准二级反应动力学拟合中最高相关系数，且所有准二级反应动力学拟合方程中的相关系数均比准一级反应动力学的相关系数高，说明5种藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基清除率，随时间的变化规律均符合准一级和准二级反应动力学模型，且准二级动力学模型拟合效果更优，即准二级动力学模型能更好地定量描述藻蓝蛋白对ABTS阳离子自由基的清除作用随时间的变化关系.

表3 反应速率常数与藻蓝蛋白色基、蛋白质含量、纯度相关性分析Tab.3 Correlation analysis between reaction rate constant and phycocyanin chromophore,protein content and purity

利用SPSS软件对表2反应速率常数k1、k2与表1中藻蓝蛋白的色基含量、蛋白质含量及纯度进行偏相关分析，结果如表3所示.由表3可以看出，在0.01水平上，藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的准一级和准二级的反应速率常数k1、k2既与蛋白质含量又与纯度呈显著正相关，但色基与其相关性不强或显著负相关，说明藻蓝蛋白在ABTS阳离子自由基体外抗氧化中，藻蓝蛋白的蛋白质可能是发挥抗氧化作用的主要部分，这与梅邢等[26]的报道一致.

以5种不同的藻蓝蛋白为原料，初步探究了5种不同藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基随时间的变化规律，建立不同质量浓度藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基反应动力学模型，并分析其反应动力学的反应速率常数与藻蓝蛋白的纯度、色基含量和蛋白质含量的相关性.结果表明，藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基具有剂量时间效应关系，即随着藻蓝蛋白质量浓度的增加和时间延长清除率升高；
随着时间的延长，5种藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的能力均增加，但反应达到平衡的时间有差异，藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的时间变化规律更适合用准二级反应动力学方程描述；
此外在ABTS抗氧化体系中，藻蓝蛋白中蛋白质含量和纯度越高时，准一级和准二级的反应速率常数也越大.但不同藻蓝蛋白清除ABTS阳离子自由基的具体机理仍有待于进一步探讨.

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