基于网络药理学和分子对接探究二氢杨梅素调脂抗肝癌的作用

谷佳， 贺卫和， 刘乐平， 刘超， 王文茂， 王炜， 覃丽

(湖南中医药大学 1.药学院干细胞中药调控与应用实验室，2.药学院中药民族药物创新发展国际实验室，湖南省长沙市410208；
3.张家界莓茶工程技术研究中心 湖南乾坤生物科技有限公司，湖南省张家界市 427000)

肝癌分为原发性和继发性两大类，与慢性肝炎病毒感染、致癌物长期暴露、过度饮酒等因素密切相关。研究表明，2020年全球肝癌发病率和死亡率在全部肿瘤中分别位居第6位和第3位[1]。中国每年死于肝癌人数占全球肝癌死亡病例数的47%[2]。肝癌的复发率高且预后较差，患者的5年生存率仅为5%～9%[3]。传统中药活性成分为近年来肝癌抗肿瘤药物研究和开发的热点，二氢杨梅素属黄酮类化合物，主要提取自葡萄科蛇葡萄属植物，在降血脂、抗肿瘤等方面具有良好疗效[4]。脂质代谢紊乱在肝癌的发生发展中具有重要作用[5]。研究表明，二氢杨梅素通过抑制脂质生成和氧化应激等途径改善肝癌细胞内脂质蓄积[6]。本文基于网络药理学和分子对接探究二氢杨梅素调节脂质代谢抗肝癌的可能作用机制，为后续相关研究奠定基础。

1.1 二氢杨梅素的作用靶点获取方法

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中以“Dihydromyricetin”为关键词检索，得到二氢杨梅素Canonical SMILES号(CS)和3D化学结构式(格式保存为“SDF”)；
利用3D结构“SDF”文件在PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)数据库中预测靶点；
利用Canonical SMILES号在SwissTarget(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库(选取“Prob”>0的靶点)和TargetNet(http://targetnet.scbdd.com/)数据库(选取“Prob”>0的靶点)中预测靶点；
在ChEMBL和TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库中以“dihydromyricetin”为关键词检索获取靶点，至少有两个数据库预测到才使用，将符合条件的靶点进行汇总，删除重复项后利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库将其转化为基因名。

1.2 肝癌和脂质代谢的相关基因获取方法

GeneCards(https://www.genecards.org/)(选取“score”>15的基因)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)数据库中分别以“liver cancer”和“lipid metabolism”为关键词检索获取基因，将符合条件基因汇总，删除重复项后利用Uniprot数据库将其转化为基因名。

1.3 二氢杨梅素调脂抗肝癌相关靶点的PPI网络构建及可视化分析

利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)找到二氢杨梅素作用靶点、脂质代谢和肝癌相关基因的交集靶点并制作韦恩图。将获得的所有交集基因导入STRING(https://string-db.org/)数据库，得到PPI网络，并导出tsv文件，利用Cytoscape对交集基因进行可视化分析并筛选出核心靶点基因。

1.4 GO、KEGG富集分析

将获得的交集基因导入Rstudio软件，进行GO、KEGG通路富集分析，将分析结果筛选汇总后绘制相关图像。

1.5 分子对接验证

将二氢杨梅素3D结构的“SDF”格式文件，利用Open Babel软件转化为“mol2”格式。通过PDB数据库下载核心靶点基因蛋白结构的“PDB”格式，利用PyMol 2.5.1软件对蛋白结构进行去水分子、去杂质、提取配体等处理，并确定对接盒子大小，利用Autodock Vina将蛋白结构的“PDB”格式文件和二氢杨梅素3D结构的“mol2”格式转为“pdbqt”格式，计算核心靶点基因与二氢杨梅素的最低结合能数值。利用PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/)数据库确定蛋白与其配体之间的相互作用，PyMol软件对结果可视化分析。

2.1 二氢杨梅素主要靶点、脂质代谢和肝癌的相关基因获取情况

在PubChem数据库中得到二氢杨梅素的2D、3D化学结构式和CS号经数据库的靶点预测和基因名转化，共获得二氢杨梅素作用靶点179个。经数据库的基因查找和基因名转化，共获得脂质代谢相关基因427个和肝癌相关基因1 246个。

2.2 二氢杨梅素调脂抗肝癌相关靶点的PPI网络构建及可视化分析情况

利用Venny 2.1.0找到二氢杨梅素调脂抗肝癌相关靶点共15个(表1)，并得到韦恩图(图1)。将获得的15个交集基因导入STRING数据库，得到PPI网络图(图2)。利用Cytoscape对交集基因进行可视化分析(图3)，并以“Degree值”大于平均值(5.6)为标准筛选出核心靶点基因9个：雌激素受体1(estrogen receptor1，ESR1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activate-d receptor gamma，PPARG)、三磷酸腺苷黏合转运体B1(ABCB1)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、细胞色素P450 1A2(cytochrome p4501A2,CYP1A2)、芳香化酶(CYP19A1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen altivator inhibitor 1,SERPINE1)、沉默信息调控因子1(silence information regulator 1，SIRT1)、CYP1B1。

表1 二氢杨梅素调脂抗肝癌靶点相关信息

图1 二氢杨梅素-脂脂代谢-肝癌靶点韦恩图

图2 交集基因互作网络

图3 交集基因可视化分析

2.3 GO、KEGG富集分析结果

通过GO功能富集分析结果显示(图4)，二氢杨梅素在分子功能(molecular function,MF)方面主要参与RNA聚合酶Ⅱ调控下DNA与转录因子的结合、DNA与转录因子的结合等过程；
在细胞组分(cellular component,CC)方面主要影响核内膜；
在生物过程(biological processes,BP)方面主要参与脂肪酸代谢、节律、类固醇代谢、炎症反应调节等。

图4 GO富集分析

KEGG通路的富集分析结果显示，共富集到25条通路与二氢杨梅素调脂抗肝癌相关，包括卵巢类固醇生成、类固醇激素生物合成、化学致癌物-受体激活等，选取前10条绘制气泡图(图5)。

图5 KEGG富集分析

2.4 分子对接验证结果

核心靶点基因CYP1B1、CYP1A2、SIRT1、PPARG、SERPINE1、ESR1、ABCB1、PTGS2、CYP19A1与二氢杨梅素的最低结合能分别为-10.3、-9.1、-9.0、-7.9、-7.8、-7.4、-7.4、-7.3、-7.1 kcal/mol(图6)。二氢杨梅素与核心靶点基因的结合能为负值即可证明受体与配体能自发结合，且所需能量越少，结合越稳定。核心靶点基因与二氢杨梅素的结合能结果均小于-5.0 kcal/mol，结合效果较好。

图6 二氢杨梅素与核心靶点基因蛋白分子对接结果

本文通过网络药理学方法筛选出二氢杨梅素调脂抗肝癌的9个核心靶点基因，并且借助分子对接方法证明二氢杨梅素与上述核心靶点基因具有较好的结合活性。研究表明，雌激素可以降低肝脏脂酶的抑制作用，升高胆固醇、甘油三酯水平，影响脂肪的存储与分布，调节血脂异常[7]。CYP19A1在雌激素合成中发挥重要作用。ESR1作为雌激素通路的关键环节与肝癌的发生发展密切相关。研究报道，ESR1在肝癌病人体内的表达较低[8]。ESR1可以促进脂肪分解，调节脂质代谢，减轻肝脏脂肪变性，还可以抑制肝癌细胞的转移与增殖[9-10]。固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol-regulatory element binding proteins-1C，SREBP-1C)是调控肝脏脂质新生的关键蛋白，在肝脏脂质代谢中发挥重要作用[11]，下调CYP1A2、CYP1B1可以抑制SREBP-1C的表达，减少肝脏脂质尤其是甘油三酯的合成，减轻肝损伤[12-13]。下调CYP1B1通过增强腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化调控肝脏中脂肪代谢相关基因，包括抑制PPARG的表达[14]。下调PPARG可以减少脂肪酸合成，阻断脂肪细胞的分化，减轻肝内脂质蓄积[15-16]。PTGS2及其合成产物在多种炎症中发挥重要作用，干扰肝脏正常脂质代谢，导致肝内甘油三酯蓄积[17]。下调ABCB1可以降低肝脏细胞的多药耐药性，这对肝脏类疾病的药物治疗具有重大意义[18]。SIRT1可以通过调节胰岛素分泌间接调节糖脂代谢[19]。研究报道，二氢杨梅素可能通过激活SIRT1-AMPK通路改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏脂质沉积[20]，与本文预测相符。上述结果可以证明网络药理学在预测二氢杨梅素调脂抗肝癌的作用机制上具有可靠性。

本文借助网络药理学的研究方法，对二氢杨梅素调节脂质代谢抗肝癌的潜在作用机制进行了研究与分析。初步推测二氢杨梅素可以通过作用于ESR1、PPARG、ABCB1、PTGS2、CYP1A2、CYP19A1、SERPINE1、SIRT1、CYP1B1等靶点，通过卵巢类固醇生成、类固醇激素生物合成、化学致癌物-受体激活等通路发挥抗肝癌的作用，且均与脂质代谢相关，这为二氢杨梅素多靶点、多通路调节脂质代谢抗肝癌提供了理论依据。

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