点击化学与生物正交化学的发展历程——浅谈2022年诺贝尔化学奖

李苏华

中山大学 化学学院，广州 510006

2022年Carolyn R. Bertozzi、Morten Meldal、K. Barry Sharpless三位教授因点击化学与生物正交化学获得了诺贝尔化学奖(图1)。诺贝尔奖官网对三位教授的贡献作了简单的描述：Sharpless教授首先提出了点击化学的概念；
接着Meldal教授和Sharpless教授分别独立发展了最为重要的点击化学——铜催化叠氮和炔的环加成反应，也是我们常说的CuAAC反应；
Bertozzi教授将点击化学发展到了一个更高的层次，即能够在极为复杂的生物体系兼容的生物正交反应。

图1 2022年诺贝尔化学奖获得者(左起分别为Bertozzi、Meldal、Sharpless, 图片来源：https://www.britannica.com/biography/)

生命世界是极为复杂多样的，但生物体所用的基本有机结构单元其实非常有限，如碱基、氨基酸、单糖，这些加起来大概也只有几十种，远少于有机合成所用的基础原料。这些结构单元只需要经过高效、精准并按照一定顺序的连接，通过构建磷酯键、酰胺键和糖苷键(图2)，就可以构建无穷多的生物大分子，如DNA／RNA、蛋白、聚糖等。而这些生物大分子分别执行不同的功能，并最终构建无穷多样的生命世界。Sharpless教授正是受此启发，提出单纯的构建连接就可以产生功能。如果能发展出少量非常高效、精准的化学连接，就能够快速构建新的功能[1]。

图2 通过构建磷酯键、酰胺键和糖苷键形成无穷多的生物大分子

在这一思想的指导下，Sharpless教授从已知反应里总结了三类最具潜力的反应[1]：第一是张力环的亲核开环(nucleophilic opening of springloaded rings)，spring-loaded是压缩的弹簧，表示具有张力或高能的分子；
第二是环加成反应(cycloaddition reactions)；
第三是保护基反应(“protecting group” reactions)，通常能用作保护基的反应都是非常高效的，也基本上是酸碱反应。下面这个反应是他给出的具体例子(图3)。如这个环氧是具有环张力的分子，叠氮化钠可以对其高效地亲核开环，得到的叠氮分子可以和缺电子的炔烃直接发生[3+2]偶极环加成，从相对简单的环氧通过两步连接就可以高效构建相对复杂的分子。值得一提的是，Sharpless提出的这三条原则对后续的点击化学发展起到非常重要的指导作用，高效的生物正交反应也遵循前两条原则。第三条保护基反应在第一代点击化学的发展中很少用到，但它促进了第二代点击化学的发展。

图3 通过简单连接构建复杂分子

点击化学最核心的理念是构建高效快速模块化的连接，在尽可能短的时间内获取尽可能多的功能。Sharpless教授最初是在1999年的美国化学年会上提出这个概念的[2]，但投稿到《美国化学会志》，直接被拒了。后来他改投到《德国应用化学》(Angew. Chem. Int. Ed.)，开始所有的评委也都拒稿，但时任主编Peter Gölitz力排众议，接收了这篇文章[1]。此后他最重要的点击化学工作都发表在《德国应用化学》上。这篇文章的引用数已经超过1万次，是《德国应用化学》历史上引用最多的文章。

概念提出后，最重要的事情就是把高效的反应做出来。根据前面提到的三类高效反应，如果能将高张力分子或高能分子和环加成结合起来，将有可能发展出一种特别高效的连接反应。事实上，Huisgen教授做了大量关于[3+2]偶极环加成反应的工作(图4)[3-4]。这个反应是4π+2π的体系，和Diels-Alder反应类似，在基态就可以反应。Huisgen教授研究了叠氮和炔的环加成反应，但常规的叠氮和炔烃反应需要比较高的温度，而且会产生1,4和1,5取代的异构体。这些早期的基础性工作使Huisgen教授成为诺贝尔奖的热门人选，但非常遗憾的是，他在2020年去世了。

图4 Rolf Huisgen教授(右)和他发展的[3+2]偶极环加成反应(图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Rolf_Huisgen)

Sharpless教授在点击化学概念性文章中展示了缺电子的炔烃可以提高效率，但这个反应仍需要在70 ℃才能反应。叠氮分子是一个高能量的分子，根据前面提出的三条原则，他希望能在叠氮和炔烃中寻找高效的连接方法。

在20世纪80～90年代，已有利用酶的空腔位点来结合小分子并促进空间邻近的两个化合物相连接的工作报道，但一般是通过巯基与羰基-α-氯代物，这类反应效率不高且有较多副反应。M. G. Finn，Sharpless教授的学生，曾在Scripps研究所独立工作，并于2013年加入佐治亚理工大学。Sharpless教授与Finn合作，利用乙酰胆碱酯酶，在其已知的两个抑制剂上分别接上不同链长的炔和叠氮，然后直接让酶去选择。酶在众多底物中选择性地将含2个亚甲基的叠氮及6个亚甲基的炔烃高效地连接起来，得到的产物是1,5-选择性的(图5，右)。通过人工合成制备了两个三氮唑的异构体，并发现1,4-三氮唑对乙酰胆碱酯酶的抑制活性相对较弱，而乙酰胆碱酯酶自身合成的1,5-三氮唑具有非常高的活性，其解离常数达到飞摩尔级别，基本可以达到这两个抑制剂理想状态下协同作用的效果(图5)。这一反应也被称为原位点击反应(in situ click chemistry)[5]。

图5 供乙酰胆碱酯酶选择性反应的端炔和叠氮抑制剂及原位反应的产物抑制剂(右)

2001年Sharpless教授因不对称氧化获得了诺贝尔化学奖，其颁奖报告中大概只有一半时间用来回顾不对称氧化反应的工作，另外一半在讲述点击化学的概念，并谈到了这个原位点击化学的工作[6]。

酶虽然可以高效促进叠氮和炔的高效连接，但由于生物体的保守性，这并不是一个通用的连接方法，还需要发展更加普适性的化学合成途径。

在Sharpless教授报道了原位点击反应没多久，丹麦哥本哈根大学的Meldal教授于2002年4月2日发表了一篇铜促进炔和叠氮高效连接的文章[7]。Meldal教授主要研究多肽合成，他发现在固相合成中，将端炔和叠氮分别引入多肽或小分子片段，然后在当量铜的作用下，这两个片段发生[3+2]偶极环加成进行连接的效率大大提高，而且选择性地得到1,4-三氮唑(图6)。这项工作发表在J. Org. Chem.上。之后，Meldal教授在这个领域里做的工作相对较少，因此可以说，他是单凭这一篇文章获奖的。

图6 Meldal教授发展的CuI促进叠氮和含端炔的多肽高效连接

在Meldal的文章发表3个月后，Sharpless教授和Valery Fokin教授一起报道了催化版本的CuAAC反应[8]。Fokin是Sharpless教授的博士后，后来留在组里做了助理教授，并在2015年左右加入南加州大学。在这个反应中，叠氮和炔在1%的铜盐催化作用下，在叔丁醇和水中室温下就可以高效地发生[3+2]环加成反应，并将两个分子片段高效连接起来。这个反应甚至可以用单质铜来催化(图7)。

图7 Sharpless教授和Fokin发展的铜催化的叠氮和炔的环加成反应

这个铜点击反应发展出来最直接的应用是能加速新化合物库的构建。例如：2个炔和2个叠氮进行组合连接，就是4个化合物；
100个炔、100个叠氮组合连接就是1万个化合物。利用这个方法，加州大学圣地亚哥分校的Eckmann教授与Sharpless教授合作，将几种有活性的含有叠氮的硝基咪唑与多种炔烃组合连接构建了一个化合物库，很快就获得了多个高活性治疗腹泻的药物分子(图8)[9-10]。这里要说明的一点是，点击化学不是关注合成三氮唑，三氮唑本身没有什么药物活性或者重要的功能，其目的仅是将两个片段连起来，而不管这个连接子是什么。当然，早期的铜反应在复杂体系的活性很低，而且铜离子有较强的细胞毒性。这些问题不解决，其应用也会大大受限。

图8 点击化学应用于组合化学快速构建化合物库

Sharpless教授特别喜欢多个连接子的化合物，经常画一些含多个端炔或叠氮的分子让学生合成出来。很多纯粹是出于好奇与好玩(Just for fun)，并非为了发文章或者其他目的。就是在这些研究中，Fokin发现部分多炔和叠氮的反应要明显快于单炔的反应。他们认为这个反应有可能有一个自催化的过程，即生成的三氮唑能催化CuAAC反应。他们对这个配体的结构进一步优化，最终发现TBTA(图9)具有较高的活性[11]。

图9 TBTA配体能大大加速CuAAC反应

有了Fokin发展的配体，Finn尝试将CuAAC反应用于更复杂的体系[12]。他选取了豇豆花叶病毒作为模型，这个病毒高度对称，有60个裸露在外的半胱氨酸残基和赖氨酸残基。通过过量的缩合试剂将它们分别接上60个叠氮。在铜和配体共同作用下，这60个叠氮可以高效地将60个含有端炔的荧光基团连接到病毒上，产率可以达到95%(图10)。这也是首次实现点击化学在生命体系中的应用。Finn通过这个展示，证明了CuAAC反应在生物体系中的应用潜能。连续60步反应要达到95%的产率，需要每步的效率高达99.9%。我们通常认为95%的产率是一个非常优秀的产率，但连续做60步只有5%左右的产率。

图10 CuAAC首次应用于生命体系

Fokin发展的TBTA配体仅能应用于一些相对简单的生物体系，在低浓度下其活性仍不够高。在他工作的基础上，Peng Wu(吴鹏)教授发展了几个更为高效的配体，BTTES和BTTPS(图11)[13-15]。Peng Wu是Sharpless教授的学生，Bertozzi教授的博士后。他发现将TBTA中的两个苄基变成叔丁基、一个苄基变成烷基磺酸酯时，可以大大提升催化效率。当叠氮的浓度是100 μmol/L时，炔为50 μmol/L，不加配体基本没有活性。TBTA催化的反应产率只有百分之十几，BTTES可以达到80%多。在配体的作用下，铜的毒性可以受到大大抑制。目前CuAAC反应水相中最好用的配体是BTTPS，如果是有机相则是BTTP。

图11 Peng Wu教授发展的几个高效的CuAAC反应配体

Wu教授目前主要研究糖化学，他将甘露糖衍生物(GDP-FucAl)通过代谢标记到斑马鱼的受精卵，然后通过BTTES促进的CuAAC反应，3 min就可以将荧光染料连接到细胞上(图12)[13]。

图12 利用甘露糖衍生物代谢标记细胞，并用配体促进的CuAAC点亮细胞

点击化学的主要目的是用尽可能短的时间获得尽可能多的功能。要实现这个目标，一是高效的反应，二是需要能用作连接子的化合物库。CuAAC反应已经非常高效，但小分子叠氮的制备相对较慢，这制约了CuAAC反应的应用。董佳家教授很好地解决了这个问题。他是Sharpless教授的博士后，回国后在中国科学院上海有机化学研究所发展了这个反应，2022年加入上海交通大学。他利用氟磺酰基叠氮重氮转移反应，将伯胺高效转化成叠氮化合物。这个反应极为高效，非常复杂的底物也可以很好地进行反应。另外，该反应可以在96孔板中进行，文章中展示了1 200多个伯胺的转化(图13)[16]。后来他在短时间内做了数以万计的叠氮化合物。这一方法大大加速了CuAAC反应在药物活性分子中的应用。

图13 董佳家教授发展的氟磺酰叠氮快速构建叠氮化合物库

除了上面列举的工作，点击化学在材料科学领域也有着非常广泛的应用，如材料的合成和修饰、刺激响应型材料、表面修饰等。

这次Sharpless教授官方的获奖理由主要是提出了点击化学概念及发展了CuAAC反应。这里也简单介绍一下他最近发展的第二代点击化学——硫氟交换反应(SuFEx)[17]。一代点击化学CuAAC反应需要预先给体系装上一个炔烃或叠氮，然后才能去做连接；
二代点击化学希望能直接与体系相互作用。这个挑战性非常大，是因为生命体系的复杂性及基本结构单元的相似性。但至少从目前看，二代点击化学提供了这样一个可能性。

Sharpless教授于2014年提出并发展了SuFEx，董佳家博士和Larissa Krasnova博士是这项工作的共同第一作者[17]。前面提到的点击化学三类反应中的保护基反应在前期发展一代点击化学时一直没有用到。硫氟交换反应最初来源于对Ts保护基的思考。一般做Ts保护醇或胺时，用TsCl产率非常高，但很少会关注到这里面的问题。Sharpless教授注意到TsCl在用作保护反应时，会有部分四价硫的副产物生成，也就是发生了氧化还原反应。他认为氧化还原反应的存在会导致这个S(VI)-Cl连接不完美，而转向六价硫氟化合物。S-F化合物在做连接时没有氧化还原反应的问题。进一步研究发现，这个硫氟键可能主要是通过氢键活化，然后在特定的方向上接受亲核试剂的进攻。这个特点使其有可能与生命体系中的某些大分子直接进行选择性相互作用。

硫酰氟可以将两个酚高效地拼接，而乙烯基磺酰氟(ESF)既可用于和胺高效连接，也可以和羰基化合物高效连接(图14)[17]。目前基于硫酰氟的SuFEx反应已经在高分子合成领域有了较好的应用，如制备聚磺酸酯[18-19]。这个聚合物的较多性能要优于结构类似的聚碳酸酯。这类氟磺酸酯另一个重要的应用是前面提到的它可以直接与细胞作用，可以在众多蛋白中高选择性地与特定蛋白的特定位点形成共价连接[20-21]。

图14 SuFEx连接

Sharpless教授于2017年发展了基于SOF4的多维点击化学[22]。在这之前，点击化学都只能实现两个片段在二维平面延伸，而利用SOF4可以实现三个片段在三维空间的高效拼接(图15)。多维点击化学目前已应用于新型螺旋聚合物的制备以及其后修饰[23]，另外还可以高选择性地直接作用于更加重要的功能蛋白，如PARP1[24]。这些和蛋白高选择性相互作用的例子证明，发展直接作用于生命体系的化学工具是可行的。多维点击化学及其应用中化学部分的工作主要由笔者在Sharpless教授课题组从事博士后研究工作期间完成。

图15 基于SOF4的多维点击化学及其在生物和高分子材料中的应用

前面提到Wu教授发展的系列配体可以将细胞毒性降到一个比较低的水平，但还是有少量毒性，因此要在活体中做反应还有困难。而生物正交反应提供了一个解决途径。

早期，Werner Reutter发现细胞能够通过代谢将非天然的唾液酸引入细胞表面[25]。Bertozzi教授希望通过在唾液酸上引入一些具有反应活性的基团，然后通过代谢将这些基团引入到细胞上，再通过特定的化学反应将外加基团与细胞相连，从而在细胞上连接特定功能的化合物。

早在1919年，Hermann Staudinger发展了利用三价有机膦化合物还原叠氮到伯胺的方法(图16)[26]。该方法会生成一个氮叶立德中间体，而这个中间体不稳定，经过水解就可以得到伯胺。因为叠氮化合物制备相对容易，该方法也是早期制备伯胺的一条简易路线。

图16 Hermann Staudinger教授(右)发展的Staudinger反应(图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Hermann_Staudinger)

尽管氮叶立德会水解，但Bertozzi教授创造性地利用了两个有机合成的基本原则让该中间体变为一个具有良好生物兼容性的偶联试剂：第一，分子内的反应要远快于分子间的反应；
第二，五元环的构建最为容易。根据这两个原则，Bertozzi教授在三苯基膦的磷原子邻位引入一个亲电试剂酯基，这样生成的氮叶立德对其发生亲核加成而从分子间变成分子内，并且生成的是五元磷杂内酰胺，可以大大加速反应，即便在有水的条件下也可以在水解之前构建两个片段的连接(图17)。利用这个方法，Bertozzi教授通过唾液酸在细胞表面引入叠氮分子，再通过连有功能基团并带有邻位酯基的三苯基膦就可以高选择性地与唾液酸上的叠氮分子反应，从而构建稳定的化学连接[27]。由于Bertozzi教授的贡献，这个反应被命名为Staudinger-Bertozzi连接反应。

图17 Staudinger-Bertozzi连接反应原理及其应用于细胞标记

在这项工作基础上，Bertozzi教授于2003年首次提出了生物正交反应的概念[28-29]，指一类反应能在生物体系中进行但不影响生物体本身。这里面有两个基本的要求：第一，反应物或反应基团是天然生物体系没有的；
第二，两个反应的基团相遇时能直接反应或在特定条件下高效、高选择性地反应。

尽管Staudinger-Bertozzi连接反应具有很好的选择性和生物兼容性，但该反应相对较慢。Bertozzi教授利用具有高张力的环辛炔与叠氮可以高效地发生[3+2]偶极环加成，构建三氮唑稳定的共价连接(图18)[30-31]。该反应相对Staudinger-Bertozzi连接反应速率有了明显的提升，并且不需要铜盐的参与，也被称为无铜的AAC反应。由于该反应的高效、高选择性，且对生物体无毒，目前该连接技术已大量应用于活体动物。值得一提的是，这个反应仍然遵循Sharpless教授在点击化学概念文章中提到的前两条原则，即张力环分子／高能分子以及环加成反应的结合。

图18 Bertozzi教授发展的高张力环辛炔与叠氮的环加成反应

这个反应存在少量副反应，如蛋白质中的半胱氨酸残基会和少量环辛炔发生thiol-ene反应(图19)[32]。

图19 半胱氨酸残基与环辛炔发生thiol-ene反应

Diels-Alder(DA)反应通过双烯体和亲双烯体反应构建六元环，是有机合成中使用最为广泛的反应之一。要使其高效反应，一般有两种策略：一种是使用富电子的双烯体和缺电子的亲双烯体，这也是正常电子需求的DA反应；
或者完全反过来，即缺电子的双烯体和富电子的亲双烯体组合，即反电子需求的DA反应。Scripps研究所的Dale L. Boger教授在反电子需求的DA反应领域中做了系统性工作，发展了系列三嗪和四嗪作为缺电子双烯体的DA反应(图20)。在该反应中先发生DA反应，再通过逆DA反应脱除一分子腈或氮气[33-36]。

图20 Dale L. Boger教授发展的反电子需求DA反应

在此基础上，特拉华大学的Joseph M. Fox教授发展了反式环辛烯与四嗪的DA反应。该反应极为快速，接了硫氧还蛋白(Trx)的反式环辛烯在15 μmol/L时能够和四嗪在5 min内反应完全(图21)[37]。这个反应同样符合Sharpless教授提出的高张力环反应及环加成反应原则。该反应的高效和高选择性，使其目前已经广泛应用于生物体系。

图21 Fox教授发展的反式环辛烯与四嗪的反电子需求的DA反应

目前该反应已经应用到了人体临床试验。例如，阿霉素可用于治疗十几种不同的癌症，包括乳腺癌、卵巢癌和肝癌，但治疗的同时会引起严重的副反应。如果将阿霉素上的氨基保护起来做成氨基甲酸酯，毒性就可以大大降低。通过先将含有上述四嗪片段的聚糖富集在肿瘤细胞附近，然后注射含反式环辛烯保护的阿霉素，这些被保护的阿霉素对身体的其他部位毒性影响相对较小，但经过肿瘤细胞时能快速与四嗪反应构建连接，富集并释放出高毒性的阿霉素，从而杀死癌细胞，达到靶向治疗的效果(图22)[38]。

图22 通过反式环辛烯与四嗪的反电子需求DA反应富集并释放高毒性药物分子

点击化学自概念的提出到后面原位点击反应、CuAAC及SuFEx反应的发展，目前已广泛应用于药物研发、生物偶联、材料等诸多领域，这一强有力的工具极大地推动了这些领域的发展。生物正交化学对生物兼容性、反应效率和选择性的追求使其成为通过化学方法研究生命体系的一个不可或缺的工具，是化学生物学的基础，并已经应用于人体的药物试验。点击化学和生物正交化学的核心都是构建高效的连接，笔者相信这一理念将指导化学家们发展出更加高效、生物兼容性更好的连接反应，并推动相关领域发展到一个前所未有的高度。

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