万仁强,刘敏婷,翁泽平,裴娜娜*
(1.广东省第二人民医院 耳鼻咽喉头颈外科,广东 广州 510317;
2.暨南大学 附属第一医院 病理科,广东广州 510630)
肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是内源性的血压、体液平衡和细胞生长调控系统,其母体化合物血管紧张素原主要于肝脏产生,由肾素(Renin)降解形成一种10肽—血管紧张素Ⅰ(AngⅠ),AngⅠ被蛋白水解酶、血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和肽链内切酶催化生成8肽的血管紧张素2(AngⅡ)和7肽的血管紧张素1-7[Ang-(1-7)]。AngⅡ也可通过ACE2作用生成Ang-(1-7)[1]。RAS成分通过不同的受体发挥不同的作用。AngⅡ通过其1型受体(AT1R)可介导血管收缩、细胞增殖、心肌肥大、纤维化、炎症等反应,而AngⅡ通过其2型受体(AT2R)则会产生相反的作用。
ACE2是ACE的同系物,ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴可拮抗经典的AngⅡ/AT1R途径以发挥抗增殖、血管扩张和抗转移等效应。研究显示,ACE2在多种肿瘤中表达降低[2-3],与乳腺癌的转移能力和肿瘤的分期呈负相关[3],并且在肝细胞癌[3]和透明细胞肾细胞癌中[4],ACE2高表达较低表达的患者有更好的预后。ACE2过表达或Ang-(1-7)治疗可抑制肺癌细胞的生长[5]和前列腺癌的转移[6]。我们前期研究表明,Ang-(1-7)过表达能抑制肿瘤生长,包括肺癌[7]、鼻咽癌[8]和肝癌[9]。但是ACE2在鼻咽癌中的表达以及对鼻咽癌细胞增殖的影响,尚未见相关报道。因此,在本研究旨在初步探讨ACE2在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞增殖的影响。
1.1.1 标本来源
收集暨南大学附属第一医院病理科2019至2021年存档,组织较大的鼻咽癌标本88例,组织学类型为非角化性癌,其中分化型6例,未分化型82例,男性66例,女性22例,年龄25~80岁,平均年龄50.3岁。对照组为确诊为鼻咽黏膜慢性炎的组织175例。
1.1.2 细胞株
鼻咽癌细胞及永生化鼻咽上皮细胞NP69由南方医科大学检验与生物技术学院生物治疗研究所李红卫教授惠赠。
1.1.3 主要试剂
RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶溶液、胎牛血清和青霉素-链霉素(10 000 U/mL)均购自Gibco公司;
总RNA提取试剂盒Qiagen RNeasy Mini kit购自 Qiagen公司;
逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM均购自Takara公司;
二乙酰胺三氮脒(diminazene aceturate,DIZE)购自MedChemExpress公司;
Ang-(1-7)ELISA检测试剂盒购自Bachem公司;
ACE2抗体和人AngⅡELISA检测试剂盒购自Abcam公司;
表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)一抗购自基因科技公司;
四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测试剂盒购自Sigma公司。
1.1.4 仪器设备
超净台购自苏净集团·苏州安泰空气技术有限公司;
倒置显微镜购自OLYMPUS公司;
CO2细胞培养箱、高速离心机均购自ThermoFisher公司;
分光光度计购自Biorad公司;
Prism® 7500荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems(ABI)公司。
1.2.1 免疫组化检测鼻咽癌组织中ACE2及EGFR的表达
免疫组化染色采用EnVision两步法,每例标本3μm,切片经脱蜡,水化;
以EDTA 9.0修复液97℃修复40min;
FLEX Peroxidase Block(DAKO)孵育10 min;
蒸馏水冲洗;
PBS浸泡15 min;
滴加一抗,室温孵育60 min,PBS浸泡20 min;
二抗孵育,室温25min,PBS浸泡20min;
DAB显色,自来水冲洗,苏木素复染。阳性对照采用肾组织切片。ACE2蛋白表达定位于细胞膜,呈棕色,ACE2结果判读由两位经验丰富的病理医师阅片。判断标准参照以下方法[9-10],综合染色强度和阳性细胞比例积分,对染色强度进行评分,不着色为0分,浅棕色为1分,棕色为2分,深棕色为3分;
再对阳性细胞的比例进行评分:阳性细胞≤1%为0分,2%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,≥75%为4分。以上两项分数相乘后分4级,0~1分为阴性(-),2~4分为弱阳性(+),5~8分为中等阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。EGFR表达定位于细胞质和细胞膜,对着色强度进行评估,不着色为阴性(-),浅棕色判为弱阳性表达(+),棕色判为中等阳性(++),深棕色判为强阳性(+++)。
1.2.2 细胞培养
人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、SUNE-1、5-8F、6-10B、HONE-1置于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)中,于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
1.2.3 荧光定量RT-PCR检测ACE2的表达
依RNA试剂盒的操作步骤提取肿瘤细胞及DIZE处理的CNE-1及5-8F细胞的总RNA,并逆转录为cDNA,-80℃保存。荧光定量RT-PCR检测ACE2的相对表达。qPCR 的反应条件:95℃30 s,95℃5 s,60℃30 s,共40个循环。ACE2上游引物5’-gtgcacaaaggtgacaatgg-3’,下游引物5’-ggctgcagaaagtgacatga-3’;
EGFR上游引物5’-gcaaattccgagacgaagcc-3’,下游引物 5’-ctgtatttgccctcggggtt-3’;
18 s 上游引物 5’-gtaacccgttgaaccccatt-3’,下游引物 5’-ccatccaatcggtagtagcg-3’。采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。
1.2.4 MTT检测细胞生长
将处于对数生长期的CNE-1和5-8F细胞经胰酶消化后铺至96孔板内,1×103个细胞/孔,设5个复孔,细胞贴壁后弃去培养液,加入含DIZE(100μmol/L)或PBS的新鲜培养液,继续培养1、2、3和4 d,后吸弃培养基,在每孔中加入含MTT 20μL(5mg/mL)的培养液,37℃继续培养4 h后终止培养,小心吸去孔内培养液,加入150μL DMSO溶液,570 nm处读取OD值,绘制生长曲线。
1.2.5 克隆形成实验
CNE-1和5-8F细胞经0.25%胰蛋白酶作用后,细胞计数并调整细胞浓度,将细胞接种于24孔板上,每孔200个细胞,每天更换含DIZE(100μmol/L)或PBS的新鲜培养液继续培养2周。弃生长液,PBS漂洗2次,甲醇5 mL固定15 min,Giemsa染液染色20min。在100倍镜下计数细胞集落(集落标准:含有50个细胞以上的细胞团为一个集落)。
1.2.6 ELISA检测AngⅡ与Ang-(1-7)含量
CNE-1和5-8F铺至24孔板内,待细胞生长至融合状态后,加入DIZE(100μmol/L),继续培养24 h后,收集细胞培养上清液储存在-20℃。用ELISA测定血浆中AngⅡ与Ang-(1-7)的水平,具体步骤按试剂盒说明书操作。于450 nm波长上读取OD值,根据标准曲线,计算AngⅡ与Ang-(1-7)的含量。
所有数据用GraphPad Prism V5.0分析,采取t检验,以P<0.05为具有统计学意义。
通过免疫组化法检测ACE2在鼻咽癌组织及黏膜慢性炎组织中的表达,结果显示,在66例鼻咽癌标本中,均未观察到ACE2的表达,而在黏膜慢性炎标本中,ACE2表达的阳性率为69.7%(图1)。
采用荧光定量RT-PCR法检测6种鼻咽癌细胞中ACE2的表达,结果显示,永生化鼻咽上皮细胞相比鼻咽癌细胞中ACE2的表达显著降低,在高分化的CNE-1细胞中的表达最高,明显高于低分化的鼻咽癌细胞(图2)。
图2 ACE2在鼻咽癌细胞中的表达Figure 2 Expression of ACE2 in NPC cells
免疫组化检测EGFR在88例鼻咽癌组织中的表达,结果显示,EGFR在鼻咽癌组织中高表达,阳性率为97.7%(图3)。
图3 EGFR在鼻咽癌组织中的表达Figure 3 Expression of EGFR in nasopharyngeal carcinoma
DIZE作用于鼻咽癌细胞后,可抑制鼻咽癌细胞CNE-1和5-8F的生长(图4)。
图4 ACE2激动剂DIZE对鼻咽癌细胞生长的影响Figure 4 Effect of ACE2 agonist DIZE on the growth of NPC cells
MTT结果显示,DIZE处理CNE-1细胞24、48 h后实验组细胞的OD值为(0.17±0.04)、(0.36±0.04),对照组细胞的OD值为(0.19±0.03)、(0.32±0.02),差异无统计学意义(P>0.05),DIZE作用72、96 h后,实验组细胞的OD值为(0.64±0.04)、(1.12±0.05),对照组细胞的OD值为(0.86±0.04)、(1.42±0.06),差异均具有统计学意义(P<0.01),见图3A。
DIZE处理5-8F细胞24、48、72 h后实验组细胞的OD值为(0.27±0.04)、(0.50±0.03)、(0.86±0.06),对照组细胞的OD值为(0.26±0.02)、(0.48±0.03)、(0.83±0.04),差异无统计学意义(P>0.05),DIZE作用96 h后,实验组细胞的OD值为(1.20±0.04),对照组细胞的OD值为(1.48±0.05),差异具有统计学意义(P<0.01),见图3B。
与PBS处理后的对照组相比,加DIZE培养2周后的鼻咽癌细胞5-8F及CNE-1增殖细胞明显减少,增殖受到抑制作用;
进一步在100倍显微镜下计细胞集落数,DIZE作用后的鼻咽癌细胞株克隆数明显减少,经统计学分析,P<0.01,可见,DIZE可抑制鼻咽癌细胞CNE-1和5-8F的克隆形成(图5)。
图5 ACE2激动剂DIZE对鼻咽癌细胞克隆形成的影响Figure 5 Effect of ACE2 agonist DIZE on the colony formation of NPC cells
DIZE处理鼻咽癌细胞24 h后,用RT-qPCR检测ACE2与EGFR的表达,采用ELISA法检测AngⅡ及Ang-(1-7)的表达,结果显示,DIZE可升高鼻咽癌细胞中ACE2及Ang-(1-7)的表达(图6A、D),降低AngⅡ及EGFR的表达(图6B、C)。
图6 DIZE对鼻咽癌细胞ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)及EGFR表达的影响Figure 6 Effects of DIZE on the expression of ACE2,AngⅡ,Ang-(1-7)and EGFR in NPC cells
鼻咽癌是我国南方以及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤,其中我国华南及港澳地区发病率最高(万分之二以上),因此,鼻咽癌也被称为“广东瘤”[10]。由于其发病部位隐匿,分化程度差,恶性程度高,易发生转移,致使60%以上的患者在早期无明显临床症状而发展到进展期且发生淋巴结转移[11]。近年来,随着在诊断和治疗方面取得的突破性进展,鼻咽癌的总体生存率显著提高[12],然而其转移率仍高居不下,成为鼻咽癌治疗失败最主要的原因,因此,探索其远处转移的分子机制,开发更多的治疗靶点及多靶点联合治疗,对于治疗及预防鼻咽癌转移、延长患者的生存期和提高生存质量具有非常重要的意义。
RAS不仅存在于所有已研究的组织、器官中,而且广泛存在于几乎所有的肿瘤细胞[13],并且某些成分的表达还与肿瘤的预后相关[14]。ACE2在多种肿瘤中表达降低[2-3],且与肿瘤的分级和预后相关。在本研究发现,ACE2在鼻咽癌中不表达,而在约69.7%鼻黏膜慢性炎标本中表达;
在鼻咽癌细胞中ACE2的表达降低,并且在高分化的CNE-1细胞中的表达高于低分化的鼻咽癌细胞,本研究结果提示ACE2的表达量与肿瘤细胞的分化相关,或许可作为一个可能的鼻咽癌标记物。
研究显示ACE2可抑制多种肿瘤的生长或转移,包括乳腺癌[2]、肝癌[3]、前列腺癌[6]和肺癌[5,15-16]。另有研究显示,ACE2-Ang-(1-7)-Mas以依赖于MasR诱导的AKT激活的方式促进肾细胞癌的迁移和侵袭[17]。可见ACE2-Ang-(1-7)-Mas在不同肿瘤中介导不同甚至相反的生物学作用。DIZE是ACE2的激动剂,可升高ACE2的活性[18-19],本研究中用DIZE处理鼻咽癌细胞,结果显示在DIZE作用后,鼻咽癌细胞中ACE2的表达升高。由于ACE2主要将AngⅡ切割成Ang-(1-7)[1],从而发挥抗肿瘤作用,另外也检测了DIZE作用后,AngⅡ与Ang-(1-7)的表达,结果显示Ang-(1-7)的表达升高,但AngⅡ的表达降低,同时抑制鼻咽癌细胞增殖,这与Ang-(1-7)在鼻咽癌中的作用相似[9],说明ACE2通过Ang-(1-7)发挥生物学作用。
EGFR是一种很有前景的癌症治疗新靶点,在大多数肿瘤中高度表达,并与更具侵袭性的表型、治疗抵抗和不良预后相关[20]。有研究指出EGFR在85%以上的鼻咽癌患者中表达。本研究检测了88例鼻咽癌组织中EGFR的表达,显示EGFR阳性率为99.97%,这与他人的研究结果相一致。本研究中ACE2的激动剂DIZE作用鼻咽癌细胞后可降低鼻咽癌细胞EGFR的表达,提示ACE2的作用可能与抑制EGFR的表达有关,但是具体的机制仍需进一步探讨。
虽然靶向治疗鼻咽癌有很好的应用前景,但其效率不高、生存期延长时间短等问题仍有待进一步解决。因此,探寻新的靶点、多靶点联合治疗有效避免上述缺陷是目前分子靶向治疗的主要研究方向。有研究显示,ACEI联合标准化疗或TKIs对一线治疗后肺癌患者的无进展生存期或总生存期均有积极的效果[21]。最近一项研究显示,在透明细胞肾细胞癌,联合应用Sunitinib(VEGFR-TKI)和Ang-(1-7),与单用Sunitinib相比,联合治疗可产生更加明显的肿瘤生长抑制效应[4],说明Ang-(1-7)增强了舒尼替尼的治疗作用。抗EGFR靶向治疗,如西妥昔单抗(CTX)和尼莫单抗(NTZ),已成为鼻咽癌的潜在治疗方法。今后我们将在本研究的基础上,进一步探索ACE2与抗EGFR联合作用对鼻咽癌的治疗效果,本研究为ACE2与抗EGFR的双靶点协同治疗鼻咽癌奠定基础。
在本研究中用IHC法未观察到ACE2在鼻咽癌标本中的表达,未能进一步分析其与临床病理特征的关系,在接下来的研究中,将在进一步扩大研究病例数的前提下,同时使用荧光定量RTPCR及Western blot进一步检测ACE2在鼻咽癌标本中的表达以及鼻咽癌患者血清中ACE2的表达情况,以探讨ACE2与临床病理特征及预后的关系,这具有重要的理论意义和临床应用价值。
综上所述,ACE2在鼻咽癌中表达降低,DIZE作为ACE2的激动剂,可升高ACE2的表达,并且抑制鼻咽癌细胞的增殖及EGFR的表达,本研究为寻找鼻咽癌治疗靶点提供新思路和方向,但其具体的分子机制以及ACE2与抗EGFR双靶点对鼻咽癌的作用仍需进一步研究。
作者贡献声明
万仁强:实验设计,研究执行,数据分析,撰写论文;
刘敏婷:实验设计,研究执行,数据分析;
翁泽平:实验设计,数据分析;
裴娜娜:项目的构思,修改论文。
利益冲突声明
本研究未受到企业、公司等第三方资助,不存在潜在利益冲突。
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