槲皮素对CuCl2,诱导的小鼠BV2,小胶质细胞神经炎症的保护机制研究

江张胜，董 婷，唐露露，赵晨玲，闻雨雅，陈 洁，江海林

（1.安徽中医药大学 研究生院，安徽 合肥 230038 ; 2.安徽中医药大学第一附属医院 脑病科，安徽 合肥 230031）

肝豆状核变性，又称Wilson 病（Wilson Disease，WD）是一种铜代谢障碍引起的隐性遗传病，除引起慢性肝脏和肾脏病变外，还可以引起中枢神经系统障碍[1-2]。小胶质细胞在神经病变中存在有益的功能，它们可以将其重塑为与免疫抑制、中枢神经系统修复相关的表型[3]。这种保护性表型的特征是促炎因子产生减少，抗炎因子产生增加以及抗氧化途径的激活，如Nrf2 途径[4-5]。NLRP3 是一种细胞内信号分子，可感知许多病原体来源、环境和宿主来源的因素[6]。IL-1β 和IL-18 的分泌需要炎症小体的激活，炎症小体是一种多蛋白寡聚体。炎性小体激活不仅在宿主防御中发挥关键作用，而且也有助于癌症、代谢、自体炎症和神经退行性疾病的发病[7]。在病理条件下，小胶质细胞释放促炎细胞因子和细胞毒因子，会加剧神经退行性疾病的进展。由于自噬与先天免疫系统和获得性免疫系统有关，自噬功能障碍与炎症、感染、神经变性和癌症也密切相关。研究表明，氧化应激和自噬在WD 神经炎症的发生和发展中起重要作用，氧化应激可以通过调控自噬形成过程中的各个途径而介导自噬，调控自噬可以进一步缓解WD 的病程[8-9]。

近年来，天然药物化学成分治疗相关疾病引起了越来越多学者的重视[10]。槲皮素在下丘脑炎症、糖尿病大鼠、大鼠骨关节炎以及视网膜色素上皮细胞中有较好的抗炎作用，但槲皮素治疗WD 神经炎症仍缺乏研究，因此有必要系统深入研究槲皮素治疗WD神经炎症的神经保护机制[11-12]。本研究从自噬的角度探讨槲皮素对WD 神经炎症的抑制作用，为临床治疗WD 神经炎性疾病提供新的治疗策略。

1.1 药品与主要试剂

槲皮素（批号：N1841，纯度≥98%）购于美国APExBIO 公司；
CuCl2溶液（批号：10125-13-0）购于国药试剂有限公司；
胎牛血清（批号：20210827）购于上海羽哚生物科技有限公司；
TNF-α ELISA 试 剂 盒（273586004）、IL-1β ELISA试剂盒（267273001）均购于莫赛飞生物科技有限公司；
兔抗LC3I/Ⅱ蛋白抗体（12741T）购于CST 公司；
兔抗Beclin-1 蛋白抗体（ab207612）、兔抗p62 蛋白抗体（ab207305）均购于Abcam 公司；
兔抗NLRP3蛋白抗体（DF7438）、兔抗Nrf2 蛋白抗体（AF0639）均购于Affinity 公司；
羊抗兔（BA1054）购于博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器

LightCycler480 II 型实时荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）；
VE-180 型免疫印迹系统（上海Tanon公司）；
Chem Studio 515 型化学发光仪（德国耶拿公司）；
CX5 型倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）。

2.1 BV2 细胞培养

选用小鼠BV2 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0493），细胞培养使用含1%双抗、10%胎牛血清DMEM 培养基。于37℃、5%CO2的培养箱中培养，将BV2 细胞培养至对数生长期以备用。

2.2 CCK8 比色法检测细胞活性

取对数生长期的BV2 细胞接种于96 孔板（每孔约5 000 个）中，每组设6 个复孔，分为给药组和铜负荷组，给药组先加50、100、200、400μmol/L 的槲皮素预处理0.5 h，再加入 CuCl2溶液使最终浓度为100μmol/L。设置观察时间为 12、24、36、48 h，置37℃、5%CO2的培养箱中孵育。依据试剂盒说明书进行操作，利用Biotok 酶标仪检测吸光度值计算。

2.3 细胞分组与干预

将BV2 细胞分为正常组、正常+槲皮素组、铜负荷组和铜负荷+槲皮素组。铜负荷组加入浓度为100μmol/L 的CuCl2溶液处理，正常组+槲皮素组加入配制好的槲皮素溶液，铜负荷+槲皮素组同时加入CuCl2溶液与槲皮素共同处理。

2.4 Western Blotting 检测Nrf2/NLRP3 信号通路相关蛋白的表达情况

取对数生长期的BV2 细胞，按照“2.3”项分组以及给药，然后将其接种于6 孔板（每孔约5×105个）中，置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24 h，将细胞消化、离心后，加入新配制的细胞裂解液在冰上裂解后收集上清并进行蛋白样本制备。将样品加入电泳孔进行SDS-PAGE 电泳，室温，200 mA 条件下转膜至PVDF 膜上，后加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，滴加一抗[LC3 Ⅰ/Ⅱ（1 ∶1 000）、Beclin-1（1 ∶2 000）、p62（1 ∶1 000）、NLRP3（1 ∶500）、Nrf2（1 ∶800）、α-tubulin（1 ∶1 000）]，4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次，每次10 min，滴加二抗（1 ∶9 000），室温封闭2 h，TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 试剂盒显影，以α-tubulin 为内参照，使用Image J 软件对图片的灰度值进行分析。

2.5 Real-time PCR检测细胞中Nrf2、NLRP3、TNF-α、IL- 1β mRNA 的表达情况

取对数生长期的BV2 细胞，按照“2.3”分组及给药，然后将其接种于6 孔板（每孔约5×105个）中，置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24 h，将细胞消化、离心后，加入TRIzol 将细胞进行裂解，提取细胞总RNA，检测RNA 浓度，按照逆转录试剂盒进行逆转录成cDNA 作为实时荧光定量模板。引物由上海新贝生物科技有限公司设计，详情见表1。反应程序：预变性95℃600 s，95℃变性10 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，进行45 个循环。按照2-△△ct的计算方法对所得结果进行计算。

表1 PCR 引物序列Tab. 1 PCR primer sequences

2.6 ELISA 检测IL-1β 和TNF-α 的含量

取对数生长的BV2 细胞，接种于6 孔板（每孔约5×105个）中，按照“2.3”项分组与干预方法，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，取上清，3 000 r/min 离心5 min，参照ELISA 试剂盒说明书检测IL-1β 和TNF-α 的含量。

2.7 统计学方法

用GraphPad Prism 8.0.1 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3.1 CCK8 比色法观察槲皮素的最佳作用浓度和作用时间

与正常组相比，50μmol/L和100μmol/L组在12、24、36、48 h 作用时间内的细胞活性无明显变化；
200μmol/L 和400μmol/L 组在36 h 和48 h 细胞活性值明显下降（P＜0.05 或P＜0.01）。因此，随着槲皮素作用时间的延长和浓度的升高，BV2 细胞活性逐渐下降。本实验将选择100μmol/L 和24 h 作为槲皮素的最佳浓度和最佳作用时间，见图1。

图1 CCK-8 法检测槲皮素对BV2 细胞活性的影响（n = 6）Fig. 1 The effect of quercetin on BV2 cell viability detected by CCK-8（n = 6）

3.2 槲皮素对BV2 细胞激活的影响

正常组的BV2 细胞形态呈圆形，细胞有较少的分支突起；
铜负荷组的BV2 细胞圆形结构遭到破坏，细胞有较为明显的触角，为激活样状态；
铜负荷+槲皮素组的BV2 细胞突起数量少而短，阿米巴样小胶质细胞数量减少，故槲皮素能够有效缓解铜负荷引起的BV2 细胞的激活，见图2。

图2 槲皮素对BV2 细胞激活的影响Fig. 2 Effect of quercetin on BV2 cell activation

3.3 槲皮素对CuCl2 刺激下BV2 炎症反应IL-1β、TNF-α mRNA 表达的影响

与正常组相比，铜负荷组BV2 细胞中IL-1β、TNF-α mRNA 表达升高（P＜0.01）；
与铜负荷组相比，铜负荷+槲皮素组BV2 细胞中两者mRNA 表达降低（P＜0.01），见图3。

图3 CuCl2 刺激下BV2 炎症反应IL-1βmRNA（A）、TNF-α mRNA（B）表达的影响（n = 3）Fig. 3 Effect of IL-1βmRNA（A）and TNF-α mRNA（B） expression in BV2 inflammatory response stimulated by CuCl2（n = 3）

3.4 槲皮素对CuCl2 刺激下BV2 细胞炎症反应IL-1β、TNF-α 含量的影响

与正常组相比，铜负荷组BV2 细胞中IL-1β、TNF-α 含量升高（P＜0.01）；
与铜负荷组相比，铜负荷+槲皮素组BV2 细胞中两者含量降低（P＜0.01），见图4。

图4 CuCl2 刺激下IL-1β（A）、TNF-α（A）含量的影响（n = 3）Fig. 4 Effect of IL-1β（A）and TNF-α（A） content under CuCl2 stimulation （n = 3）

3.5 槲皮素对CuCl2刺激下BV2细胞的Nrf2和NLRP3表达的影响

与正常组相比，铜负荷组NLRP3 的蛋白表达量升高（P＜0.01）；
与铜负荷组相比，铜负荷+槲皮素组Nrf2 的蛋白表达量升高（P＜0.01），NLRP3 的蛋白表达量降低（P＜0.01）。表明槲皮素通过激活Nrf2 途径降低CuCl2导致的氧化应激水平从而抑制NLRP3 炎性小体的激活，见图5。

图5 CuCl2 刺激下 BV2 细胞Nrf2 和NLRP3 蛋白表达的结果（n = 3）Fig. 5 Expression of Nrf2 and NLRP3 in BV2 cells stimulated by CuCl2（n = 3）

与正常组相比，铜负荷组NLRP3 的mRNA 表达量升高（P＜0.01）；
与铜负荷组相比，铜负荷+槲皮素组Nrf2 的mRNA 表达量升高（P＜0.01），NLRP3 的mRNA 表达量降低（P＜0.01），见图6。

图6 CuCl2 刺激下BV2 细胞Nrf2 mRNA（A）和NLRP3 mRNA（B）表达的结果（n = 3）Fig. 6 Expression of Nrf2 mRNA（A） and NLRP3 mRNA（B） in BV2 cells stimulated by CuCl2（n = 3）

3.6 槲皮素对CuCl2 刺激下BV2 自噬阻滞现象的影响

与铜负荷组相比，铜负荷+槲皮素组p62 蛋白表达量降低（P＜0.01），Beclin-1 蛋白表达量与LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化增加（P＜0.01），进一步证明了槲皮素提高了BV2 细胞中的自噬水平，见图7。

图7 CuCl2 刺激下BV2 细胞中自噬阻滞现象的影响（n = 3）Fig. 7 Effect of autophagy block in BV2 cells stimulated by CuCl2 （n = 3）

槲皮素可通过调控自噬过程来提高神经系统的稳定性，免受氧化应激的损伤，并且可通过促进PINK1、parkin 蛋白的表达水平，激活线粒体自噬来抵抗脑组织的损伤[13]。本研究根据前期文献的报导探索了槲皮素是否可通过调控自噬来减轻CuCl2引起的细胞炎症损伤，结果表明槲皮素可有效减轻CuCl2引起的自噬阻滞，降低BV2 细胞的炎症因子IL-1β 和TNF-α mRNA 的表达水平，同时IL-1β和TNF-α 的含量也降低。

Nrf2/NLRP3 通路是体内重要的抗炎、抗氧化信号通路。本研究结果显示，铜负荷组中NLRP3 蛋白表达量较正常组高，表明CuCl2刺激后BV2 细胞中NLRP3 炎性小体被激活而导致炎症反应，与之前的研究结果相一致[14]；
并且铜负荷组中Nrf2 表达量较正常组高，提示CuCl2刺激后BV2 细胞Nrf2 表达升高，从而发挥抗氧化、抗炎作用。铜负荷+槲皮素组中Nrf2 的表达含量较铜负荷组明显升高，而NLRP3 的表达量降低，提示槲皮素可提高Nrf2 的表达从而更好的发挥抗炎效果。为进一步验证本实验的结果，采用RT-qPCR 检测Nrf2、NLRP3 mRNA 表达情况，数据显示，槲皮素可提高Nrf2 mRNA 的表达水平而降低NLRP3 mRNA 的表达水平，故槲皮素能通过Nrf2/NLRP3 通路发挥抗炎、抗氧化的作用。

本研究采用CuCl2刺激的BV2 细胞为体外模型，从自噬的角度探讨槲皮素对炎症的抑制作用。结果显示，槲皮素能够通过调控Nrf2/NLRP3 通路降低CuCl2刺激的炎症水平、促进细胞自噬，这将为槲皮素用于治疗WD 提供实验基础。研究结果对深化其发病机制和中医药理论与研究具有重要意义，但其具体的分子机制仍需通过动物模型进一步验证。

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