自噬相关调控蛋白与糖尿病心肌病关系的研究进展

邱 奇，陈永锋，孙正宇，康品方

(蚌埠医学院第一附属医院心内科，安徽 蚌埠 233004)

糖尿病已成为当今世界最常见和最严重的慢性疾病之一。根据国际糖尿病联盟(IDF)于2021年12月6日发布的《IDF糖尿病地图(第10版)》数据显示：到2021年，全球20～79岁成年人中，5.366亿人患有糖尿病，预计到2045年，患糖尿病的人数可达到7.832亿；
其中，中国糖尿病患者人数最多，到2021年为止，中国有1.4亿人患有糖尿病(占中国总人口的10%)，预计到2045年可能突破1.74亿人次[1]。糖尿病会引起一系列致死致残、代价高昂的并发症，严重危害人们的身心健康，并对社会财政产生沉重负担。其中，心血管异常，特别是糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者发生心力衰竭甚至心源性死亡的主要原因之一。DCM目前仍没有明确的定义，最普遍接受的定义是指糖尿病病人在没有其他心血管疾病(如冠心病、无法控制的高血压、严重的瓣膜心脏病和先天性心脏病)的情况下出现心脏代谢障碍。DCM的病理特点主要为早期的左心室舒张功能障碍，并伴有心肌细胞肥大、心肌纤维化和细胞凋亡的增加。早先的研究已经证明，高血糖、胰岛素抵抗、自由基产生增加、脂质过氧化、线粒体功能障碍、内皮功能障碍等均参与了DCM的发生、发展。近年来，随着自噬机制的深入研究，自噬失调已被认为是DCM的另一个潜在发病机制[2]。但有关调控自噬相关蛋白所获得的影响并没有相应完整的描述。因此，本文将对目前研究较多的自噬相关调控蛋白与DCM的关系进行系统综述。

自噬是一种细胞内高度保守的由溶酶体介导的降解代谢过程，目的是清除和重新利用长寿命蛋白质、畸形蛋白质以及受损的细胞器等细胞质内容物。根据底物转运到溶酶体的方式以及生理功能的差异，自噬可分成三种类型：宏自噬(macroautophagy)、微自噬(micro-autophagy)和伴侣介导的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)。宏自噬是最普遍的也是当前研究最为广泛且清晰的自噬形式，本文之后所描述的自噬均为宏自噬，其过程包括自噬的启动、自噬小泡(Phagophore)的成核(形成碗状膜结构)、延伸，自噬体(autophagosome)的形成，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome)，继而其内容物在溶酶体的帮助下被降解后转运回胞浆中供细胞重新利用。自噬最初被认为是细胞内非选择性代谢过程，然而，最近的研究表明，酵母菌和哺乳动物中普遍存在多种类型的选择性自噬(选择性自噬指在某些情况下，自噬可以专一的识别、隔离和降解特定的大分子或细胞器)，其中以特定降解受损线粒体或细胞内过量线粒体以维持能量代谢平衡的线粒体自噬(Mitophagy)目前在DCM中研究最为普遍和透彻。

当前研究已经证实，自噬在DCM发生发展过程中起到关键性的作用，且在不同类型的糖尿病心脏中作用不尽相同。

2.1 自噬在1型糖尿病心脏中的作用虽然早先有研究提出，在1型糖尿病中，胰岛素的绝对缺乏可阻碍葡萄糖和脂肪酸的有效吸收，使受影响的细胞处于饥饿状态；
胰岛素信号的减弱以及饥饿信号的增强会导致自噬水平的增强，自噬的增强补偿了1型糖尿病患者维持心脏功能的能量不足[3]。此观点随后在链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病小鼠模型及大鼠模型中再次获得了验证[4-5]。然而，最近更多研究认为在1型糖尿病中，心肌细胞的自噬是受到抑制的。此结论在OVE26小鼠模型(常用的1型糖尿病基因工程动物模型)、STZ诱导的1型糖尿病小鼠及大鼠模型中都得到证实[6-8]。糖尿病心肌细胞的自噬抑制可能造成凋亡信号增加、氧自由基持续积累、线粒体和内质网应激延长，从而直接或间接介导DCM的发生、发展。

2.2 自噬在2型糖尿病心脏中的作用目前关于2型糖尿病心肌细胞的自噬情况，研究界仍没有一个准确的定论。有研究发现，高脂饮食(high-fat diet，HFD)(60 kcal% fat)诱导的2型糖尿病小鼠，其心肌细胞的自噬通量前期增加，在6周时达到顶峰，随后逐渐减弱，在2个月后恢复到基线水平；
进一步研究发现，增加的自噬主要为线粒体自噬[9]。如果抑制HFD诱导的2型糖尿病小鼠心脏中的线粒体自噬，会导致受损线粒体的堆积以及随后心脏结构和功能的障碍，加剧心肌病；
而激活线粒体自噬可以预防HFD诱导的DCM[10]。线粒体自噬对于2型糖尿病心脏功能的维持至关重要。相反，一些研究声称，自噬的过度激活阻碍心肌细胞的存活，可能是2型DCM的发病机制之一[11]。同时也有一部分研究发现在db/db小鼠中(经典的自发性2型糖尿病小鼠模型)，心肌细胞的自噬是受到抑制的，且随着自噬抑制的恢复，DCM得到明显的改善[12]。因此，无论是1型DCM还是2型DCM，自噬状态都仍未明确，需要进一步的研究确认。

3.1 Beclin1Beclin1由BECN1基因所编码，是酵母自噬相关蛋白6(autophagy associated protein 6，Atg6)在人类中的同源蛋白，通过与Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶(Class III PI3K，PI3KC3，又称Vps34)的相互作用，从而介导自噬小泡的产生及成熟。Beclin1含有BH3结构域(Bcl-2同源结构域)，可与Bcl-2及Bcl-xl的BH3受体结构域结合；
Bcl-2对Beclin1有“隔离”作用，两者之间的结合降低了Beclin1与Vps34的相互作用，从而抑制了自噬。在慢性间歇性缺氧处理的人冠状动脉内皮细胞中，miR-34a-5p的过表达就通过抑制Bcl-2，从而上调Beclin1介导的自噬效应；
该研究认为，自噬—凋亡相互作用是应激心肌细胞的一种重要保护机制[13]。同时最近的一篇综述提到，Beclin1的过表达(超过阈值)，会诱导多种癌细胞的凋亡增加[14]。Beclin1作为沟通自噬与凋亡的关键因子，可能成为DCM治疗的有效靶点。现已有研究报道，姜黄素及白藜芦醇可通过破坏Bcl-2与Beclin1的结合，增强心肌细胞自噬并减轻细胞凋亡，以达到预防DCM的作用[15-16]。

3.2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3激酶相关激酶(PI3KK)超家族，其在调控细胞生长增殖和维持代谢平衡中起重要作用。mTOR的活化受到多种细胞信号的调控，包括胰岛素、氨基酸、葡萄糖、细胞能量水平和应激等。mTOR在传导信号时，会形成两种不同的三元复合物mTORC1和mTORC2。其中，mTORC1可在自噬启动、自噬小泡成核延伸以及晚期自噬小体成熟与自噬流终止等多时相中发挥自噬抑制作用。mTOR的过度激活和磷酸化，使心肌细胞自噬处于极低水平，被认为是高糖导致心脏损害的机制之一[17]。而褪黑激素、胰升血糖素样肽1受体激动剂exendin-4和liraglutide均可以通过逆转高糖诱导的mTOR的过度激活或磷酸化，从而减弱葡萄糖中毒引起的心脏损害[18-19]。

3.3 AMP激活的蛋白激酶AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种高度保守的由一个催化亚单位α及两个调节亚单位β和γ组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其对细胞内ATP/AMP比例变化敏感，在调节葡萄糖稳态、脂质代谢、蛋白质合成及线粒体生物合成中发挥核心作用。AMPK可被细胞内AMP的升高和(或)ATP的降低激活，AMPK的激活会促进自噬的发生。当细胞耗能增加或ATP生成减少时，AMPK主要通过磷酸化结节性硬化症复合体2(TSC2)及mTOR调控相关蛋白(RAPTOR)来降低mTORC1的活性，从而减弱mTORC1对自噬的抑制作用，同时AMPK也可以直接磷酸化ULK1来启动自噬。此外，AMPK还通过磷酸化Beclin1、Vps34、Atg9、FoxO3来调节自噬，并且AMPK还参与线粒体自噬。目前，大多数的研究认为，AMPK的活性降低和mTOR的过度激活导致自噬的抑制是糖尿病心脏损害的主要机制，激活AMPK和抑制mTOR可能成为DCM的有效靶点。事实上，西那卡塞、达格列净以及替格瑞洛都可以通过激活AMPK减缓DCM的进展[20-21]。

3.4 叉头盒O叉头盒O(Forkhead box O，FoxO)是一类以保守的110个氨基酸所构成的DNA结合结构域(称为“叉头盒”结构域)为特征的转录因子亚家族，在多种类型细胞中，参与调节细胞代谢、增殖、氧化应激反应、免疫稳态和细胞死亡。在哺乳动物中主要有FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6四种类型，其中FoxO1和FoxO3在维持心脏功能方面起着关键作用。FoxO可以作为转录因子，与启动子结合，诱导自噬相关基因的转录。FoxO的转录诱导能力受到磷酸化、乙酰化/去乙酰化和泛素化三种翻译后修饰的调节。胰岛素或胰岛素样生长因子可通过PI3K-Akt途径使FoxO1和FoxO3磷酸化；
磷酸化的FoxO会在14-3-3蛋白的作用下发生核排斥，从而抑制其转录调节功能。而AMPK可通过磷酸化胞浆中的FoxO3，促进其核转位。FoxO1可被CBP等组蛋白乙酰转移酶乙酰化，而胞核中的NAD+依赖性去乙酰化酶Sirt1可使FoxO1去乙酰化，从而增强其对自噬基因的转录激活。此外，细胞质中被磷酸化的FoxO还可发生多泛素化继而被蛋白酶体降解。FoxO1的持续活化引起自噬的过度激活、心肌细胞凋亡增加，可能是DCM发展的核心机制之一。血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)及1,25-维生素D3可通过抑制FoxO1的核转位，降低自噬相关基因的过度表达，从而减轻糖尿病心脏的心室功能障碍、纤维化和心肌细胞凋亡[22-23]。相反，有研究报道，在400 μM的棕榈酸处理24 h的H9C2细胞和人AC16细胞中，过氧化物酶(PXDN)的表达水平增加，并通过抑制FoxO1的表达与活性削弱自噬，参与DCM的发病[24]。但由于该结论缺乏相应动物实验，因此仍需进一步验证。

3.5 NF-E2相关因子2NF-E2相关因子2(Nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2)是一种转录因子，能够诱导多种细胞保护基因的表达，在抵御氧化应激损害，调节细胞生存、增殖和铁代谢中发挥重要作用。正常生理条件下，Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)相互作用并发生泛素化，继而被蛋白酶体降解，使自身处于低水平状态；
氧化应激时，Keap1半胱氨酸残基的修饰使Nrf2从泛素化降解体系中释放出来，释放的Nrf2进入细胞核，并与抗氧化反应元件(antioxidant response elements，AREs)的增强子序列结合，诱导相应细胞保护基因的表达。自噬衔接蛋白SQSTM1/p62可以通过其Keap1相互作用区(KIR)与Keap1结合，从而阻碍了Keap1与Nrf2的结合，使Nrf2的泛素化受损。自噬失调会使SQSTM1/p62在胞浆中过度聚集，连同结合的Keap1一起装载入自噬体中进行降解，进而使Nrf2得以从Keap1介导的泛素化降解中释放而被激活。最近有研究报道，糖尿病心脏中Nrf2和Keap1表达减少并伴随着心肌细胞凋亡和自噬的增加，别嘌呤醇可能通过提高Nrf2水平逆转高血糖引起的氧化应激、细胞凋亡增加及自噬过度激活，从而缓解DCM[5]。相反，在自噬受损的DCM中，Nrf2通过自噬溶酶体途径被激活，Nrf2介导的转录增强，促进脂质的过氧化，同时Nrf2介导的抗氧化防御及铁代谢平衡发生障碍，导致心肌细胞铁死亡，从而加剧了DCM的发展[25]。但是，由于目前研究Nrf2在DCM中的实验很少，Nrf2与自噬失调的因果关系及Nrf2是否能直接影响自噬调节仍不明确。

上述自噬相关调控蛋白为当前DCM中研究较多且可直接作用于自噬通路的关键因子。此外，液泡膜蛋白1(VMP1)、高迁移率组框1(HMGB1)、表皮生长因子受体(EGFR)、BIRC5等均可调控自噬，但其在DCM中缺乏文献报道，因此本文就不具体详述。

综上所述，自噬失调在DCM发生、发展中起到关键性作用，且在不同类型的糖尿病心脏中自噬情况有所不同。Beclin1、mTOR、AMPK、FoxO及Nrf2等自噬相关调控蛋白均参与了糖尿病的心脏损害，并被认为是治疗DCM的潜在靶点。然而，自噬在DCM中的具体状态及确切作用机制尚不十分清楚，自噬相关因子之间的相互作用也没有被完全揭示，甚至在相似的研究中存在矛盾的报道，这些问题仍需进一步研究解决。

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