乙肝肝硬化患者血液维生素D和肝功能及淋巴细胞亚群分析

马 雯，李 芹，郭 媛，何瑞芬，朴文花

（1.宁夏回族自治区人民医院，西北民族大学第一附属医院临床医学检验诊断中心，银川 750002；
2.西北民族大学第一临床医学院检验系，银川 750002）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，是肝硬化发生的主要原因之一。全球30%以上的肝硬化病例与HBV感染有关，已成为严重的公共卫生问题[1]。维生素D是一种类固醇激素，在体内可调节钙磷水平，确保骨骼正常生长。研究[2]表明，维生素D具有一定的免疫调节功能，能够参与细胞增殖、分化、免疫与抗炎等。近年来，维生素D在肝硬化发展过程中的调节作用备受关注。维生素D可调节肝炎病毒的复制，减缓肝硬化的进程，还可通过与免疫细胞上的特异性维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）结合，直接或间接作用于肝硬化患者的淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，抑制其增殖、分化功能，发挥其对机体免疫系统的调控作用[3]。因此本研究旨在通过分析乙肝肝硬化患者血清维生素D、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、乙肝病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus nucleic acid，HBV DNA）、Child-Pugh评分及淋巴细胞亚群比例，探讨维生素D与乙肝肝硬化患者肝功能及免疫功能的相关性。

1.1 一般资料

选择宁夏回族自治区人民医院2018年1月至2020年12月门诊及住院首次诊断乙肝肝硬化且尚未开始临床抗病毒及其他治疗的患者89例，其中男性46例，女性43例。所有患者乙肝表面抗原（HBsAg）均为阳性，且符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[4]中乙型肝炎肝硬化的诊断标准。排除其他病毒性肝炎、酒精性肝炎以及慢性肝病导致的肝硬化者，无合并急慢性感染、冠心病、糖尿病、肾脏疾病等患者；
排除近12个月服用过维生素D制剂及影响维生素D生成及吸收的相关疾病者；
排除孕产妇及哺乳期、备孕期妇女。Child-Pugh评分参照《肝硬化诊治指南》[5]要求：A级为5～6分，B级为7～9分，C级为10～15分。选择同期我院健康管理中心92例健康体检者作为对照组，其中男性47例，女性45例。使用深圳双佳SK-CK超声波体检机测量入组患者的身高、体质量及身体质量指数（body mass index，BMI），并统计每周运动情况。

1.2 标本采集与处理

采集患者空腹静脉血标本，EDTA-K2抗凝全血用于淋巴细胞亚群检测，血清标本用于乙肝五项、维生素D、ALT、AST、ALB、TBIL及HBV DNA的检测。

1.3 仪器与试剂

乙肝五项采用美国雅培i4000SR全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂、定标液和质控品检测。血清维生素D使用德国西门子公司ADVIA Centaur XP免疫发光分析仪及配套试剂、定标液和质控品检测。根据中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会发布的《维生素D及其类似物临床应用共识》规定，维生素D＞30 ng·mL-1为维生素D充足，20～30 ng·L-1为维生素D不足，＜20 ng·mL-1为维生素D缺乏[6]。血清ALT、AST、ALB及TBIL使用德国西门子公司ADVIA 2400全自动生化分析仪及配套试剂、定标液和质控品检测。HBV DNA使用德国凯杰Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪检测。试剂由湖南圣湘生物科技有限公司提供，试剂盒最低检出值为30 IU·mL-1，定量检测线性范围为1.0×102～5.0×109IU·mL-1。外周血淋巴细胞亚群检测使用美国Becton Dickson公司生产的FACS AriaⅡ流式细胞仪检测，检测试剂（货号662966）、溶血素、鞘液均购自美国Becton Dickson公司。该试剂盒含有FITC标记的CD3，克隆SK7；
CD8藻红蛋白（PE），克隆SK1，CD4别藻蓝蛋白（APC），克隆SK3。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，正态分布资料组间比较采用成组t检验，不服从正态分布的资料采用Mann-Whitney检验，组间每周运动情况比较采用卡方分层法，相关性采用Pearson相关分析。乙肝肝硬化患者不同维生素D组间比较使用单因素方差分析，方差不齐时采用Brown-Forsythe检验，并使用LSD-t法进行两两比较。计数资料的组间比较采用χ2检验，图表使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行绘制。P≤0.05为差异有统计学意义。

2.1 一般资料

两组患者性别、年龄、身高、体质量、BMI及每周户外运动情况间比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），乙肝肝硬化组维生素D含量低于对照组（P＜0.05），见表1。乙肝肝硬化组维生素D充足者13例、维生素D不足者24例、维生素D缺乏者52例，不同维生素D水平患者年龄、身高、体质量、BMI及每周户外运动情况间比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表2。

表1 对照组和乙肝肝硬化组患者一般资料比较

表2 不同维生素D水平乙肝肝硬化患者一般资料比较

2.2 乙肝肝硬化组患者维生素D与肝功能相关性分析

ALT、AST、TBIL及HBV DNA指标与维生素D均无相关性（P均＞0.05），ALB与维生素D呈正相关（r=0.214，P=0.044），Child-Pugh评分与维生素D呈负相关（r=-0.300，P=0.004），见图1。

图1 乙肝肝硬化患者维生素D与肝功能相关性分析

2.3 不同维生素D水平乙肝肝硬化患者淋巴细胞亚群比较

乙肝肝硬化不同维生素D水平患者外周血CD3+T细胞百分比和CD4+T细胞百分比组间比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。CD8+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值组间比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。维生素D不足者、缺乏者与充足者相比，CD8+T细胞百分比增加（P均＜0.01），而CD4+/CD8+比值降低（P＜0.05），见表3。

乙肝肝硬化是HBV感染并进一步发展为肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖的终末阶段。机体免疫细胞在清除乙肝病毒的同时不断地损伤肝细胞，导致正常肝细胞外基质降解、纤维瘢痕组织聚集、血管扭曲变形以及多种细胞因子释放，使患者出现门静脉高压、循环障碍、腹腔积液、黄疸、消化道出血及肝性脑病等症状，给患者和社会带来沉重的负担。研究[7]表明，处于肝硬化阶段的患者常表现出不同程度的免疫功能紊乱，尤其是细胞免疫失调。作为具有免疫调节功能的类固醇激素，维生素D在乙肝肝硬化的发展过程中发挥着重要作用。

维生素D的含量与年龄、性别、生活方式以及日照强度等均有关系，本研究中乙肝肝硬化组血清维生素D含量低于对照组，且有85.4%的乙肝肝硬化患者出现了维生素D不足，提示乙肝肝硬化患者存在普遍且严重的维生素D缺乏。维生素D在生成过程中需要在肝脏中进行羟基化，因此肝细胞的损失必然导致维生素D合成的异常。另外，活性维生素D生成后需要与VDR结合，经维生素D结合蛋白运输到靶器官才能发挥生理作用，但肝硬化阶段肝细胞合成能力下降，使维生素D的运输受到限制，进而导致外周血维生素D减少。近93%的慢性肝脏疾病患者会出现不同程度的维生素D缺乏，维生素D的缺乏与感染、并发症的发生、肝脏纤维化程度及病死率的增加均有关联[3，8]。本研究也发现，乙肝肝硬化患者血清维生素D含量与ALB含量呈正相关，与Child-Pugh评分呈负相关，与ALT、AST、TBIL及HBV DNA含量无线性关系。ALB的含量可以反映肝脏细胞的合成能力，进一步提示维生素D的含量与肝脏合成功能相关。另有研究[9-10]发现，慢性肝脏疾病患者血清维生素D含量与Child-Pugh评分存在负相关性，并证实补充维生素D后患者预后好于对照组。本研究未发现维生素D与ALT、AST及TBIL之间存在相关性，与相关报道一致[11]。HBV DNA定量结果能够反映患者感染后乙肝病毒在体内的复制情况，是治疗过程中重要的监测指标。Ko等[12]发现，慢性乙肝患者HBV DNA与维生素D浓度呈负相关，高文等[13]称维生素D与HBV DNA含量无相关性，与本研究结果相同，因此考虑需要增加乙肝肝硬化临床病例的收集，扩大样本量对此结果进行确认。

在乙肝病毒感染肝细胞并导致肝硬化的过程中，维生素D可通过调节细胞免疫应答发挥作用。研究表明，维生素D可参与T细胞协助B细胞产生抗体并诱导粒细胞趋化，还能协助抗原提呈并产生多种细胞因子完成病毒的清除[12]。本研究中，依照维生素D含量对乙肝肝硬化患者分组比较，虽未观察到CD3+T细胞百分比和CD4+T细胞百分比组间的显著性差异，但仍可见乙肝肝硬化患者体内随维生素D减少会出现T淋巴细胞总数的下降，后续需要对此结果再次深入探究。CD8+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值组间比较差异有统计学意义，且维生素D不足者、缺乏者与充足者比较后发现CD8+T细胞百分比增加，CD4+/CD8+比值减少，说明乙肝肝硬化患者免疫细胞比例失调，且维生素D浓度与患者体内的免疫功能紊乱存在一定的联系。有报道[12]称，维生素D能够促进T淋巴细胞向受损且炎性反应较重的肝组织迁移，从而改善机体的损伤。同时，高浓度的维生素D可进一步抑制适应性免疫和CD8+T细胞的增加，从而减轻炎性反应，与本研究结果类似。在细胞实验和动物实验中均已证实，维生素D可通过与VDR的结合，参与CD4+T细胞分泌白细胞介素（IL）-2、γ干扰素（IFN-γ）及IL-17等，调节机体的免疫状态[14]。由此可见，维生素D发挥免疫调节作用时，不仅能够对免疫细胞数量或免疫细胞比例产生影响，还能进一步通过调节T细胞的增殖及其分泌的细胞因子发挥免疫调节作用。

乙肝肝硬化患者维生素D与肝细胞功能及细胞免疫的相关性已被证实，并有研究认为维生素D与乙肝肝硬化的严重程度相关[11，15]，但具体的调节机制还需进一步深入探究。近年来，对肝硬化过程中VDR、VDR基因多态性以及维生素D结合蛋白的研究也从另一个角度阐明了维生素D免疫调节的相关机制[16-17]，为今后乙肝肝硬化的基础研究和临床治疗提供了新的思路。

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