积雪草苷对癫痫小鼠认知功能、炎症反应、氧化应激及沉默信息调节因子1/内质网应激通路蛋白的影响研究Δ

何 冰，杜丽叶，李志华，谢 洋，刘莉燕#，房娉平

(1.邯郸市中心医院康复科，河北 邯郸 056000；

2.邯郸市中心医院神经内五科，河北 邯郸 056000)

目前癫痫(epilepsia，EP)的治疗以西药治疗为主，但仍有约1/3的患者无法利用药物控制EP，继而发展成为难治性EP，严重影响患者健康[1-2]。传统中药积雪草为伞形科植物积雪草的干燥全草，常用于调控神经系统、治疗精神类疾病。积雪草苷(AS)从积雪草中提取而来，具有抗氧化、保护缺氧心肌细胞、抗纤维化等药理作用，可用于心脑血管疾病的治疗，还可以增强痴呆患者的认知能力，但对于能否提高EP患者认知能力及相关机制鲜有报道[3-4]。沉默信息调节因子1(SIRT1)在细胞整个过程的发展中发挥重要作用。内质网(ER)存在于真核生物中，参与类固醇、蛋白质、脂质、糖原等合成，可以维持细胞稳态，而氧化应激、钙离子失衡等多种因素会引起内质网应激(ER stress)[5]。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种脱乙酰酶，参与细胞分化、增殖、衰老和凋亡的发生。Li等[6]的研究结果发现，激活SIRT1表达可以减轻ER stress，进而改善糖尿病小鼠的认知功能。但SIRT1/ER stress通路是否参与AS对EP的影响尚不清楚。本研究通过构建EP小鼠模型，探索AS对EP小鼠认知功能、炎症反应、氧化应激及SIRT1/ER stress通路蛋白的影响，以期为EP的治疗寻找新的潜在药物。

1.1 材料

1.1.1 动物：BALB/c小鼠60只(北京脑科学与类脑研究中心提供)，雄性、清洁级、6周龄，体重23～28 g，动物生产许可证号为SCXK(京)2020-0005。所有小鼠饲养于22～25 ℃(温度)、55%～65%(湿度)环境中，给予小鼠充足的光照、水及饲料。

1.1.2 仪器：Morris水迷宫(型号:ACT-200A)、酶标仪(型号:Fax-20100)和凝胶成像系统(型号:Gelstudio)均购自张家港市青松生物医学仪器有限公司。

1.1.3 药品与试剂：AS(原料药，纯度≥98.8%，批号为JXC-02)购自桂林纽泰生物科技有限公司；
丙戊酸钠片(批号为20210611，规格为0.2 g)购自湖南省湘中制药有限公司；
氯化锂溶液(批号为TW2917)、匹罗卡品(批号为TW2920)、白细胞介素6(IL-6，批号为TW11676)、超氧化物歧化酶(SOD，批号为TW12776)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和蛋白提取试剂盒(批号为TW19124)均购自上海通蔚实业有限公司；
肿瘤坏死因子α(TNF-α，批号为SP32174)、丙二醛(MDA，批号为SP38199)ELISA试剂盒均购自武汉赛培生物科技有限公司；
SIRT1(批号为ab110304)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP，批号为ab192591)、免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP，批号为ab21685)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK，批号为ab229912)、磷酸化PERK(p-PERK，批号为ab169528)、真核翻译起始因子-2α(eIF2α，批号为ab30271)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α，批号为ab30276)、β-肌动蛋白(β-actin，批号为ab19115)单克隆抗体均购自美国Abcam公司；
羊抗鼠二抗(批号为SAB450017)购自上海易汇生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠EP模型的制备：所购小鼠适应性喂养1周后，参照文献[7]的造模方法制备EP小鼠模型。经小鼠腹腔注射氯化锂溶液180 mg/kg，30 min后腹腔注射匹罗卡品30 mg/kg，观察小鼠EP发作程度。EP持续状态(SE)称为EP发作，参照Racine分级标准[8]，当SE不低于Ⅲ级发作视为造模成功。若小鼠未达到Racine分级Ⅲ级及以上标准，则此后每隔30 min给予匹罗卡品追加剂量10 mg/kg腹腔注射，直至出现Racine分级Ⅲ级及以上标准为止。匹罗卡品的最大注射剂量为60 mg/kg，若达到最大剂量仍未造模成功，则更换新的小鼠重新造模，造模过程小鼠无死亡。成功造模50只小鼠。

1.2.2 分组及给药：将成功造模的50只小鼠随机分为模型组，AS低、中及高剂量组，阳性对照组，每组10只。另取10只健康小鼠作为对照组(对照组小鼠仅按“1.2.1”中的方法腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液)。AS低、中及高剂量组小鼠分别给予20、40及80 mg/kg的AS进行灌胃干预(AS和蒸馏水相溶配制成质量浓度分别为2、4及8 mg/mL的溶液，灌胃体积10 mL/kg)[9]；
阳性对照组小鼠给予0.2 g/kg的丙戊酸钠进行灌胃干预(丙戊酸钠和蒸馏水相溶配制成质量浓度为0.02 g/mL的混悬液，灌胃体积10 mL/kg)[10]；
模型组、对照组小鼠灌胃等量蒸馏水；
1日1次，干预2周。

1.2.3 观察小鼠SE次数及总持续时间：观察并记录小鼠干预2周之后的第1日的SE次数及总持续时间。

1.2.4 小鼠认知功能检测：采用Morris水迷宫实验测定小鼠认知功能[11]。将水池等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个象限，将平台置于第Ⅰ象限中央并低于水面2 cm，每日上下午从Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限区域将小鼠放入水中，记录其寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期，该值越长表明小鼠的认知功能越差；
若小鼠在90 s内仍未找到平台，则引导其找到平台，并记为90 s，持续训练4 d，每日训练4次，逃避潜伏期取4次的平均值。第5日撤去平台，记录120 s内小鼠游过平台位置的次数，游过的次数越少表明小鼠的认知功能越差。

1.2.5 ELISA法检测小鼠血清中IL-6、TNF-α水平以及脑组织中SOD、MDA水平：待小鼠认知功能检测结束后，采用戊巴比妥钠麻醉小鼠，取眼部血液，离心用于ELISA法检测小鼠血清中IL-6、TNF-α水平。断头处死小鼠，解剖分离小鼠脑组织，离心取上清液，一部分用于ELISA法检测小鼠脑组织中SOD、MDA水平；
另一部分储存于-80 ℃冰箱，用于后续蛋白质印迹法检测。

1.2.6 蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中SIRT1/ERstress通路蛋白表达：取上述适量脑组织，提取总蛋白、检测总蛋白浓度，电泳分离目的蛋白，转膜，脱脂奶粉封闭。依次加入稀释的SIRT1(1∶ 500)、CHOP(1∶ 500)、BIP(1∶ 500)、PERK(1∶ 300)、p-PERK(1∶ 300)、eIF2α(1∶ 400)、p-eIF2α(1∶ 400)、β-actin(1∶ 1 000)一抗于4 ℃冰箱中孵育过夜。洗膜后，加入二抗(1∶ 2 500)室温孵育2 h，显色、拍照、收集图像，用Image J软件分析灰度值，得到目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

2.1 各组小鼠SE次数和总持续时间比较

与对照组相比，模型组小鼠SE次数和总持续时间增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，AS低、中、高剂量组以及阳性对照组小鼠SE次数和总持续时间降低(P<0.05)，AS低、中及高剂量组呈剂量依赖性(P<0.05)，差异均有统计学意义；
AS高剂量组与阳性对照组小鼠SE次数和总持续时间的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组小鼠SE次数和总持续时间比较

2.2 各组小鼠认知功能比较

与对照组相比，模型组小鼠逃避潜伏期延长，游过平台位置的次数减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，AS低、中、高剂量组以及阳性对照组小鼠逃避潜伏期缩短，游过平台位置的次数增加(P<0.05)，AS低、中及高剂量组呈剂量依赖性(P<0.05)，差异均有统计学意义；
AS高剂量组与阳性对照组小鼠逃避潜伏期和游过平台位置次数的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组小鼠逃避潜伏期和游过平台位置次数比较

2.3 各组小鼠血清IL-6、TNF-α以及脑组织SOD、MDA水平比较

与对照组相比，模型组小鼠血清IL-6、TNF-α以及脑组织MDA水平升高，脑组织SOD水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，AS低、中、高剂量组以及阳性对照组小鼠血清IL-6、TNF-α和脑组织MDA水平降低，脑组织SOD水平升高(P<0.05)，AS低、中及高剂量组呈剂量依赖性(P<0.05)，差异均有统计学意义；
AS高剂量组与阳性对照组小鼠血清IL-6、TNF-α以及脑组织MDA、SOD水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组小鼠血清IL-6、TNF-α和脑组织SOD、MDA水平比较

2.4 各组小鼠脑组织SIRT1/ER stress通路蛋白表达水平比较

与对照组相比，模型组小鼠脑组织SIRT1蛋白表达水平降低，CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，AS低、中、高剂量组以及阳性对照组小鼠脑组织SIRT1蛋白表达水平升高，CHOP、BIP、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α蛋白表达水平降低(P<0.05)，AS低、中及高剂量组呈剂量依赖性(P<0.05)，差异均有统计学意义；
AS高剂量组与阳性对照组小鼠脑组织SIRT1、CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表达水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1、表4。

表4 各组小鼠脑组织SIRT1/ER stress通路蛋白表达水平比较

A.对照组；
B.模型组；
C.AS低剂量组；
D.AS中剂量组；
E.AS高剂量组；
F.阳性对照组

EP是一种因大脑神经元同步异常放电而引发的慢性神经系统疾病，不仅影响患者的生活质量，还会伴随抑郁、认知缺陷和焦躁等并发症的出现[12]。目前，治疗EP的药物易产生精神和运动等方面的不良反应，且30%的患者会对EP治疗药物产生耐药性，故寻求临床不良反应低的潜力药物和疗法非常重要[13]。氯化锂-匹罗卡品联合使用可造成动物中枢神经系统兴奋，在短时间内产生EP症状，引发呼吸障碍、脑组织缺血缺氧，促使炎症反应、氧化应激发生，导致脑神经细胞凋亡，损坏认知功能[14]。本研究采用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品建立EP小鼠模型，当SE不低于Ⅲ级发作时，表明造模成功，可用于下一步的研究。

积雪草是《中华人民共和国药典：一部》(2010年)收载的中药，味苦、辛，性寒，有清热利湿、解毒消肿的功效，常用于治疗皮肤创伤、痈疽、热证等，具有较广的药用价值，AS是积雪草中的活性成分[3]。Zhang等[15]的研究结果发现，在脑缺血再灌注损伤模型中，AS降低了细胞凋亡、炎症和氧化应激水平，为治疗脑损伤提供了新途径。Guo等[16]的研究结果证明，AS可以减轻自噬体的形成以及自发改变行为的损伤，可有效预防大鼠脑缺血介导的认知障碍和神经元损伤。在EP发病过程中，过度兴奋的大脑神经元会刺激炎症细胞释放大量的炎症因子，引发一系列炎症反应进而导致细胞损伤，其中TNF-α作为炎症趋化因子，可导致炎症级联反应，进而加剧炎症损伤；
IL-6的释放将导致大量活性氧产生，进一步加重氧化应激损伤。一旦有大量活性氧生成，便会加大SOD需求量，活性氧破坏分子结构，产生MDA，因此，SOD、MDA含量在一定程度上代表氧化应激的反应程度[17]。本研究结果发现，模型组小鼠SE次数和总持续时间、逃避潜伏期，血清IL-6、TNF-α水平，以及脑组织MDA水平高于对照组，游过平台位置的次数少于对照组，脑组织SOD水平低于对照组；
经AS干预后，小鼠SE次数和总持续时间、逃避潜伏期，血清IL-6、TNF-α，以及脑组织MDA水平降低，游过平台位置的次数增加，脑组织SOD水平升高。表明AS可以降低炎症反应、氧化应激程度，改善EP小鼠的症状及认知功能，但具体研究机制还有待探索。

SIRT1是广泛分布于细胞内、生物学功能较广的一种酶。研究结果表明，上调SIRT1的表达对醋酸铅诱导的小鼠认知障碍，具有保护作用[18]。ER stress是由细胞内环境失衡造成的亚细胞器发病过程，与EP脑损伤中异常蛋白质的加工密切相关[19]。Zhang等[20]研究结果发现，补肾益智方可以通过增加SIRT1的蛋白质表达，降低ER stress相关蛋白表达，改善小鼠认知功能障碍。本研究结果发现，模型组小鼠脑组织SIRT1蛋白表达水平低于对照组，CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表达水平高于对照组；
经AS干预后，小鼠脑组织SIRT1蛋白表达水平升高，CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表达水平降低。表明AS可以激活EP小鼠SIRT1蛋白表达，缓解脑组织ER stress。

综上所述，AS可以改善EP小鼠的认知功能，降低小鼠的炎症反应及氧化应激程度，可能与激活SIRT1蛋白表达、缓解ER stress有关。但由于EP作用机制复杂，进一步的机制有待研究。

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