饲喂卵黄抗体对美洲鳗鲡抵御嗜水气单胞菌感染的影响

张丽娟 ，陈强 ，杨金先 ，李英英 ，2，宋铁英 ，葛均青 *

（1.福建省农业科学院生物技术研究所，福州350003；
2.福建省特种水产配合饲料重点实验室，福州350300）

鳗鲡是我国重要的淡水经济鱼类之一，主要养殖区集中在福建省和广东省，2021年产量达到255311t[1]。高密度集约化养殖模式导致病害发生越发频繁。嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是一种短杆状的革兰氏阴性兼性厌氧菌，隶属于气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是鳗鲡等经济鱼类的重要致病病原。感染嗜水气单胞菌后，病鱼体表充血，腹腔积水并伴溶血，引发败血症，发病率及致死率极高，给养殖业造成严重的经济损失[2]。目前，针对嗜水气单胞菌病的防控主要是使用抗生素，迫切需要寻找抗生素替代药物[3]。

卵黄抗体（Egg yolk antibody）是一种存在于免疫后母鸡卵黄中的免疫球蛋白（Yolk Immunoglobu lin，IgY）。母鸡经免疫刺激后，产生的IgY会在卵黄成熟期从血液转移并富集至卵黄中[4]。IgY具有特异性高、无毒性、产量高、成本低和理化性质稳定等特点[5]。研究表明，IgY能有效预防和控制细菌性疾病[6-8]。Cai Ruizhao等研究发现，特异性IgY可显著降低小鼠感染创伤弧菌（Vibrio vulnificus）后腹腔和血液中TNFα的表达水平，降低炎症反应，提高小鼠存活率[9]。Qin Zhendong等研究发现，特异性IgY具有保护团头鲂（Megalobrama amblycephala）免受嗜水气单胞菌感染的潜力，并使肠道和脾脏免受细菌损伤[10]。

本研究将嗜水气单胞菌免疫蛋鸡，获得含特异性抗体的卵黄浆，添加至鳗鲡饲料中，与添加对照卵黄浆的饲料及未添加卵黄浆的饲料分别饲喂美洲鳗鲡，并对美洲鳗鲡进行嗜水气单胞菌攻毒，观察攻毒后美洲鳗鲡组织的病理学变化情况，分析组织中细胞因子的表达情况，以评价卵黄抗体对美洲鳗鲡抵御嗜水气单胞菌感染的影响。

1.1 试验材料

嗜水气单胞菌L316由本研究室分离并保存[11]；
美洲鳗鲡（Anguilla rostrata）购自长乐某鳗鲡养殖场，规格为80～120 g/尾，常规饲料投喂，日常养殖水温25℃；
Trizol试剂（Invitrogen，Cat.No.15596026）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，试剂盒Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和 SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；
MyD88、TGFβ、TNFα、IL-1β和18S引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 嗜水气单胞菌特异性卵黄抗体制备及效价测定

嗜水气单胞菌L316灭活疫苗根据参考文献[12]进行制备，具体步骤如下：嗜水气单胞菌L316在TSB培养基中25℃培养，以1%福尔马林室温灭活24 h，灭菌PBS清洗2次并将菌浓度调至1×109cfu/mL，再与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂以体积比1:1混匀、乳化。90日龄海兰灰蛋鸡80只随机分成2组，试验组蛋鸡注射制备好的灭活疫苗，免疫间隔2周，对照组蛋鸡未注射疫苗。在试验组第3次免疫后，收集鸡蛋，取蛋黄，氯仿抽提法提取卵黄抗体[13]；
用间接ELISA检测免疫后鸡蛋卵黄中特异性抗体效价[14]，以嗜水气单胞菌作为包被抗原，一抗为不同稀释度的特异性卵黄抗体或对照卵黄抗体，二抗为1：5 000稀释的羊抗鸡IgY-HRP。酶标仪测定595 nm处吸光度值，以A试验组/A对照组比值超过2.1为阳性标准。

1.2.2 美洲鳗鲡的卵黄抗体饲喂及嗜水气单胞菌攻毒

取嗜水气单胞菌特异性卵黄抗体效价达到1：10 000以上的试验组鸡蛋卵黄，以体积比1:1与生理盐水（0.85%NaCl）混匀，制成特异性抗体卵黄浆（L316-IgY）。取对照组鸡蛋卵黄按上述方法制成非特异性抗体卵黄浆（NS-IgY）。

取养殖的健康美洲鳗鲡，随机分为3组，每组30尾。L316-IgY组饲喂的饲料添加5%L316-IgY，NS-IgY组饲喂的饲料添加5%NS-IgY，Ctr组饲喂的饲料为未添加卵黄浆的常规饲料。每日投饵率0.5%，持续喂食，第31天，3组美洲鳗鲡腹腔注射嗜水气单胞菌L316，剂量为1×106cfu/尾。

1.2.3 美洲鳗鲡组织的病理学观察

攻毒后第7天，取L316-IgY组、NS-IgY组和Ctr组美洲鳗鲡，经MS-222麻醉后，解剖取鳃、肠道、肝脏和肾脏等组织，以4%多聚甲醛固定液固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后浸蜡与包埋，切片机切片，石蜡切片脱蜡并水化，再依次经苏木素、伊红（hematoxylin-eosin，H.E）染色后脱水封片[15]，显微镜下观察并采集图像。

1.2.4 美洲鳗鲡组织细胞因子的表达水平分析

攻毒后第3天和第7天，取L316-IgY组、NSIgY组和Ctr组美洲鳗鲡各4尾，经MS-222麻醉后，采集鳃、肠道、肝脏和肾脏等组织，Trizol法提取组织总RNA，用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000测定RNA浓度。根据GeneBank上发表的鳗鲡基因序列设计 MyD88、TGFβ、TNFα 和 IL-1β 引物。取 1μg RNA， 用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒反转录为cDNA，再利用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒进行MyD88、TGFβ、TNFα 和 IL-1β 的定量 PCR， 以 18S为内参基因，2-△△ct法计算 MyD88、TGFβ、TNFα 和IL-1β的相对表达量。

1.3 数据分析

采用EXCEL进行数据处理，显著性水平采用GraphPad Prism 8.0软件进行双因素方差分析（Two-Way ANOVA），结果以平均值±标准误（mean±SEM）表示，P<0.05表示差异显著。

2.1 嗜水气单胞菌卵黄抗体对美洲鳗鲡的组织病理学影响

嗜水气单胞菌攻毒L316-IgY组、NS-IgY组及Ctr组美洲鳗鲡后，第7天的组织病理学观察显示，3组鳃和肠道均无显著病变；
L316-IgY组的肝脏无明显病变、细胞排列紧密，NS-IgY组的肝脏细胞间隙增大，Ctr组肝脏细胞间隙增大、肝索与肝组织分离；
L316-IgY组和NS-IgY组的肾脏无显著病变，细胞排列紧密，组织结构完整，Ctr组的肾脏出血、空泡，肾小管肿胀等（图1）。

图1 嗜水气单胞菌攻毒后美洲鳗鲡的组织病理变化

2.2 嗜水气单胞菌卵黄抗体对美洲鳗鲡鳃细胞因子表达的影响

L316-IgY组、NS-IgY组及Ctr组美洲鳗鲡饲喂第31天进行嗜水气单胞菌攻毒，定量PCR对鳃组织的细胞因子表达情况的分析结果显示：攻毒后第3天，L316-IgY组和NS-IgY组MyD88表达显著下调，但两组之间差异不显著；
L316-IgY组TGFβ表达显著上调，NS-IgY组的TGFβ表达量在L316-IgY组和Ctr组之间，但无显著差异；
L316-IgY组TNFα表达显著上调，并且显著高于NS-IgY组的表达，NS-IgY组TNFα表达与Ctr组相当；
攻毒后第7天，3组鳗鲡鳃中相关细胞因子的表达水平无显著差异（图 2）。

图2 嗜水气单胞菌攻毒后美洲鳗鲡鳃细胞因子的表达

2.3 嗜水气单胞菌卵黄抗体对美洲鳗鲡肠道细胞因子表达的影响

美洲鳗鲡肠道细胞因子表达的定量PCR分析显示：与Ctr组相比，攻毒后第3天，L316-IgY组和NS-IgY组MyD88表达显著下调，两组之间差异不显著；
攻毒后第7天，MyD88的表达无显著差异，但L316-IgY组MyD88表达较NS-IgY组显著降低；
L316-IgY组和NS-IgY组IL-1β的表达均高于Ctr组，但L316-IgY组与Ctr组的差异不显著，NS-IgY组较Ctr组相比差异显著，而L316-IgY组和NS-I-gY组间差异不显著（图3）。

图3 嗜水气单胞菌攻毒后美洲鳗鲡肠道细胞因子的表达

2.4 嗜水气单胞菌卵黄抗体对美洲鳗鲡肝脏细胞因子表达的影响

肝脏细胞因子表达的定量PCR分析显示，攻毒后第3天，饲喂卵黄组TGFβ表达显著下调，但两组之间差异不显著；
L316-IgY组TNFα表达显著上调，但与NS-IgY组无显著差异；
攻毒后第7天，L316-IgY组TGFβ表达显著上调，而NS-IgY组的表达与Ctr组无显著差异；
L316-IgY组TNFα表达与Ctr组相比无显著差异，但显著高于NS-IgY组，而NS-IgY组的表达与Ctr组相比无显著差异（图4）。

图4 嗜水气单胞菌攻毒后美洲鳗鲡肝脏细胞因子的表达

2.5 嗜水气单胞菌卵黄抗体对美洲鳗鲡肾脏细胞因子表达的影响

肾脏细胞因子表达的定量PCR分析显示：与Ctr组相比，攻毒后第3天，L316-IgY组MyD88表达显著下调；
NS-IgY组TNFα表达显著上调；
饲喂卵黄组IL-1β的表达显著上调，但两组间差异不显著；
攻毒后第7天，L316-IgY组和 NS-IgY组MyD88、TGFβ和TNFα的表达均显著上调，但两组间差异不显著（图5）。

图5 嗜水气单胞菌攻毒后美洲鳗鲡肾脏细胞因子的表达

卵黄抗体由于其理化性质稳定、安全、产量大且特异性强等优势，在防治畜禽及水产疾病的应用中受到越来越多的关注[16]。卵黄抗体可特异性结合抗原从而达到治疗疾病的效果；
马有智等发现，注射嗜水气单胞菌卵黄抗体可提高棘胸蛙感染嗜水气单胞菌的存活率，保护率可达到100%，并且可加快感染损伤的恢复[17]。本研究的组织病理学观察显示，饲喂含特异性抗体的卵黄浆后，降低了嗜水气单胞菌攻毒造成的美洲鳗鲡肝脏和肾脏损伤。

王仁宝等研究发现，通过口服特异性卵黄抗体，能够显著提升对虾的免疫酶活力和免疫基因表达水平，提高了对虾抗病毒和细菌感染的能力[18]。MyD88表达下调，可保护机体免受内毒素休克的影响[19]。吴家玉等研究发现，异育银鲫下调机体MyD88、NF-κB等细胞因子的表达，可降低感染嗜水气单胞菌组织的损伤[20]。嗜水气单胞菌可造成机体急性炎症反应[21]，组织中MyD88下调表达，可抑制美洲鳗鲡急性炎症反应。TGFβ具有调节炎症发生和降低炎症的作用[22]；
TNFα在炎症、细胞增殖、分化和凋亡中都发挥了重要作用[23]；
IL-1β是一种多效的促炎细胞因子，参与机体多种生理和病理过程，可引发炎症反应[24]。TGFβ、TNFα、IL-1β 上调表达，可促使机体炎症反应的发生，从而清除病原菌。本研究中饲喂含特异性抗体的卵黄浆后，显著提高了组织中TGFβ、TNFα、IL-1β的表达，攻毒后第3天显著降低了组织中MyD88的表达水平，而在攻毒后第7天上调了肾脏中MyD88的表达水平。组织中相关细胞因子的表达水平改变，提升了攻毒美洲鳗鲡的免疫保护力，增强了其抵御嗜水气单胞菌感染的能力。

本研究显示，饲喂非特异性卵黄浆也能有效降低美洲鳗鲡感染嗜水气单胞菌造成的肾脏损伤；
饲喂非特异性卵黄浆显著上调组织中TGFβ、TNFα、IL-1β的表达，显著下调MyD88的表达。卵黄中含有的卵磷脂、胆固醇、叶黄素、可溶性蛋白等可影响促炎和抗炎途径[25]。

IgY、α-、β-、γ-livetin 等可促进机体对多种病原体的被动免疫[26]，通过调节细胞因子的表达发挥抗炎作用[27]。

本研究表明，饲喂嗜水气单胞菌特异性抗体卵黄浆或非特异性卵黄浆均可减轻美洲鳗鲡对嗜水气单胞菌攻毒的组织病变程度，增强美洲鳗鲡抵御嗜水气单胞菌感染的能力，并调节美洲鳗鲡组织中细胞因子的表达水平，其中特异性卵黄抗体对美洲鳗鲡抵御感染能力的提升作用更显著。

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