微小RNA-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素在慢性心力衰竭患者中的表达及联合检测的意义△

李 嘉，郑志君，王晓蕊，赵小丹，苗昌荣

（唐山市协和医院心内科，河北唐山 063000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是在原有慢性心脏疾病上发展至心力衰竭症状和体征的一组复杂临床综合征，主要临床表现为液体潴留和活动耐量受限，常因各种诱因急性加重需住院治疗，因此，早期诊断极为重要［1］。目前临床对心力衰竭的诊断几近完善，普遍使用氨基末端脑钠肽前体诊断和评估预后［2］，但其易受诸多非心源性疾病影响，且仅能反映心力衰竭一个方面，还需探索更多的生物标志物。研究表明，心肌缺氧、炎症反应、心肌纤维化在CHF 发生和发展中发挥重要作用［3-5］。Chouvarine 等［6］通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）阵列分析发现，微小RNA（microRNA，miR）-197 在心肌缺氧诱导的心力衰竭小鼠模型中表达上调。半乳糖凝聚素-3为一种炎症信号分子，可通过诱导单核细胞迁移促进血管炎症反应［7］。骨膜素是心脏间充质组织发育中重要细胞外基质蛋白，研究报道其与压力超负荷引起的心肌纤维化相关［8］。本研究旨在分析CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度变化，探讨三者联合预测CHF 的价值。

1.1 一般资料

选取唐山市协和医院2019 年1 月至2020 年12月收治的128例CHF患者为CHF组，其中男80例，女48例；
年龄为（60.24±5.68）岁；
体质量指数（22.44±2.12）kg/m2；
纽约心脏协会（New York Heart Associ⁃ation，NYHA）［9］心功能分级：27 例Ⅰ级、43 例Ⅱ级、36 例Ⅲ级、22 例Ⅳ级。纳入标准：（1）符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》［9］CHF 诊断标准；
（2）年龄≥18 岁；
（3）临床资料完整；
（4）患者及家属均知情研究。排除标准：（1）血液、免疫、造血系统疾患者；
（2）恶性肿瘤患者；
（3）严重肝、肾功能障碍患者；
（5）近3 个月内口服抗凝药物患者；
（6）肺源性心脏病、心脏瓣膜病、急性心肌梗死患者。另选取同期60 名体检健康者为对照组，其中男37 名，女23 名；
年龄为（59.85±5.72）岁；
体质量指数为（21.72±2.28）kg/m2。两组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经伦理委员会批准（批号：201803245）。

1.2 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度测定方法

采集CHF组患者入院时和对照组受试者体检时静脉血6 mL，3 000 r/min 离心10 min（半径10 cm），取上清，其中3 mL 加入Trizol（北京普利莱基因技术有限公司，货号：R1030）提取血清RNA，TaKaRa逆转录试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，货号：RR036A）转录合成cDNA，进行qRT-PCR 反应。miR-197 正向引物5"-ATTACTTTGCCCATATTCAT⁃TTTGA-3"，反向引物5"-ATTCTAGAGGCCGAGGC⁃GGCCGACATGT-3"。反应体系：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.2 μL 正向引物，0.2 μL 反向引物，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，6.0 μL ddH2O；
扩增条件：95℃90 s，95℃30 s，63℃30 s，72℃30 s，循环40 次。以U6 做内参校正，正向引物5"-CTCGCTT⁃CGGCAGCACA-3"，反向引物5"-AACGCTTCAC⁃GAATTTGCGT-3"，2-ΔΔCt法计算血清miR-197 相对表达量。另3 mL 酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）测定半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度，试剂盒由上海瓦兰生物科技有限公司提供，货号：E00033、E07024。

1.3 超声心动图检查

CHF 患者入院后采用飞利浦Epiq 7C 彩色超声诊断仪（X5-1 探头频率：1～5 MHz）进行超声心动图检查，测定左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD），双平面Simpson 法测量左心室射血分数（left ventricu⁃lar ejection fraction，LVEF）。

1.4 观察指标

（1）比较两组受试者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度和心功能指标；
（2）比较不同心功能分级CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度；
（3）分析CHF患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度与心功能指标的相关性；
（4）分析血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度对CHF 的预测价值。

1.5 统计学分析

选用SPSS 26.0统计学软件。计数资料以［n（%）］表示，采用卡方（χ2）检验。正态分布计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验；
偏态分布计量资料以M（QL～QU）表示，两组间比较采用Z检验。相关性采用Pearson/Spearman 相关性分析。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度对CHF 的预测价值，曲线下面积（area under the curve，AUC）采用Z检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 两组受试者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度比较

CHF 组患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组受试者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度比较 ［M（QL～QU），±s］

表1 两组受试者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度比较 ［M（QL～QU），±s］

2.2 两组受试者心功能指标比较

CHF 组患者LVEDD、LVESD 明显高于对照组，LVEF 明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组受试者心功能指标比较［M（QL～QU），±s］

表2 两组受试者心功能指标比较［M（QL～QU），±s］

2.3 不同心功能分级CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度比较

NYHA 心功能Ⅲ～Ⅳ级患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度明显高于Ⅰ～Ⅱ级患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同心功能分级CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度比较 ［M（QL～QU），±s］

表3 不同心功能分级CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度比较 ［M（QL～QU），±s］

2.4 CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度与心功能指标的相关性

Pearson/Spearman 相关性分析结果显示，CHF患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度与LVEDD、LVESD 呈正相关，与LVEF 呈负相关（P＜0.05），见表4。

表4 CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度与心功能指标的相关性分析结果

2.5 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度对CHF 的预测价值

ROC 分析结果显示，三项联合预测CHF 的AUC 明显大于miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素单独预测（Z=3.720、3.977、2.965，P=0.000、0.000、0.003），见表5、图1。

表5 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度对CHF 的预测价值

图1 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度预测CHF 的ROC 图

心力衰竭是各种心血管疾病的必然终点，随着人均寿命的延长，心力衰竭患病率逐年上升，2012～2015 年我国心力衰竭患病人数较过去15 年增加了900 多万人［10］，住院病死率高达4.1%［11］，疾病形势严峻。目前尚不完全明确其发病机制，现有研究证实其涉及氧化应激、炎症反应、心脏基质重构、心肌损伤、心肌牵拉、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、神经内分泌激素激活、肾功能不全等多个方面［2］。尽管近年来医学技术的发展丰富了临床治疗手段，但现有措施仍以改善或控制CHF 临床症状为主，并不能从根本上逆转其病理改变，因此，还需探索更多生物标志物，为研究CHF 机制提供基础。

MiR 能通过与靶基因mRNA 的3"非翻译区的碱基互补结合，使靶基因mRNA 翻译抑制和降解，近年研究表明，多种miR与CHF发生、发展相关［12］。MiR-197 广泛表达于心、肝、肺、胃肠道等组织，与多种肿瘤发生密切相关［13-14］。近年研究发现，miR-197 还与心肌损害有关，如miR-197 为心肌梗死差异表达miR，血液循环中miR-197 是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者心血管死亡独立风险因子（HR=1.77）［15-16］。本研究结果显示，CHF 组血清miR-197 浓度明显升高，说明miR-197可能参与CHF 发生。进一步分析显示，心功能Ⅲ～Ⅳ级患者血清miR-197 浓度明显提升，并与LVEDD、LVESD、LVEF 存在显著相关性，说明miR-197还与CHF患者心功能改变有关，参与CHF发展，其机制可能与miR-197 通过诱导心肌细胞凋亡参与CHF 发生、发展有关。Zampetaki 等［15］和Schulte等［16］研究表明miR-197 与心肌损害密切相关。髓系白血病-1 能结合B 淋巴细胞瘤-2 基因家族促凋亡成员，发挥抗心肌细胞凋亡作用［17］。刘祖霞等［18］通过高糖诱导建立糖尿病心肌病模型发现，miR-197 能靶向负调控髓系白血病-1 促进心肌细胞活力降低和凋亡。

炎症反应为心力衰竭重要病理生理机制之一，可能早于典型神经激素激活，通过诱导心肌细胞凋亡、心肌纤维化、促进心室重构等多种途径参与心力衰竭发生、发展［2］。半乳糖凝聚素-3 为β-半糖苷动物凝集素家族成员，主要由巨噬细胞活化产生，通过非经典途径分泌到细胞表面及细胞外空间，能促进炎症细胞活化和放大炎症反应［19］。已有研究报道其参与动脉粥样硬化、脓毒症等炎症疾病进展［20-21］。本研究结果显示，CHF组患者血清半乳糖凝聚素-3 浓度明显升高，说明半乳糖凝聚素-3 可能参与CHF 发生。进一步分析显示，心功能Ⅲ～Ⅳ级患者血清半乳糖凝聚素-3浓度明显提升，并与LVEDD、LVESD、LVEF 存在显著相关性，说明半乳糖凝聚素-3 还与CHF 患者心功能改变有关，参与CHF 发展。分析是因为半乳糖凝聚素-3 作为一种炎性介质，其高表达会加重心脏组织炎症反应，促进CHF 发生。基础实验显示，心包内注射半乳糖凝聚素-3 会加重心力衰竭小鼠心脏组织炎症损伤，并通过多条信号通路导致心肌纤维化和心室重构［22-23］。

心脏成纤维细胞为调节细胞外基质合成与降解的主要细胞，心肌受损时会移至受损区域形成胶原纤维等修复心肌，若成纤维细胞过度增殖、细胞外基质胶原分泌增加、胶原比例失调则会改变心脏组织胶原成分，导致心肌纤维化［24］。骨膜素是新近发现的一种分泌型可溶解性细胞间基质蛋白，主要由细胞间成纤维细胞产生，能促进成纤维细胞增殖和细胞外基质蛋白的合成能力，影响胶原纤维的成熟度与融合［25］。近年研究报道，肺组织和气道组织纤维化状态下，骨膜素表达显著上调［26］。本研究结果显示，CHF 组血清骨膜素浓度明显高于对照组，说明骨膜素可能参与CHF 发生。进一步分析显示，心功能分级Ⅲ～Ⅳ级患者血清骨膜素浓度明显提升，并与LVEDD、LVESD、LVEF存在显著相关性，说明骨膜素还与CHF 患者心功能改变有关，参与CHF 发展。推测与骨膜素大量表达导致心脏成纤维细胞过度增殖和细胞外基质蛋白合成引起心肌纤维化有关。Kaur 等［27］建立心肌梗死小鼠模型发现，敲除骨膜素蛋白表达能减少小鼠心肌纤维化，改善心功能，佐证了本研究结果。其机制可能与骨膜素通过转化生长因子-β/骨形态发生蛋白信号通路促进组织纤维化有关［28］。本研究ROC 分析结果显示，血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度均可作为CHF 预测指标，且三项联合预测的AUC 显著增加，说明联合检测血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度能提升CHF 预测价值。

综上所述，CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素浓度明显提升，与心功能密切相关，联合检测能提升CHF 预测价值。

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