基于核酸适配体荧光标记及荧光共振能量转移检测赭曲霉毒素A

刘诺亚， 赵新月， 张晓萌， 宋玉竹， 张金阳， 韩芹芹*

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500)

赭曲霉毒素是曲霉素和青霉素产生的一种次级代谢产物，共有7种结构类似物，其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是分布最广、毒性最强的一种[1]，它主要作用于动物的肝脏和肾脏，具有肾毒性、肝毒性、致癌性和致畸性，被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定为ⅡB类致癌物[2]。人体摄入OTA的途径有两种，一种是直接食用被OTA污染的谷物，如玉米粉，红薯粉等；
另一种是食用体内残留OTA的动物食物[3]。为了保障人体的健康，我国规定了OTA在食品中的限量标准，根据国标(GB2761-2017)《食品中真菌毒素限量》[4]，谷物及其研磨加工品中OTA最高浓度为5 μg/kg。因此，食品中OTA的检测具有重要意义。目前已有多种方法检测OTA，如高效液相色谱法[5]、液相色谱-质谱联用法[6]、酶联免疫吸附分析[7]、薄层色谱法[8]等。这些方法虽然灵敏度高，但是存在复杂的样品前处理、昂贵的仪器、成本高、制备困难以及检测周期长等缺点[9]。因此，开发方便、快捷检测OTA的方法引起了大家的广泛关注。

近年来，由于核酸适配体具有成本低、强特异性、稳定性高等特点，成为了新的研究热点[10]。核酸适配体是单链DNA或RNA通过折叠、卷曲为特定三级结构，具有特定功能的分子，它主要通过体外指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从随机寡核苷酸文库中筛选得到[11]。应用核酸适配体检测OTA的方法有比色法[12]、电化学法[13]和光学检测法[14]等。其中，根据物质间能发生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)、内滤效应(Inner Filter Effect,IFE)、光诱导电子转移(Photo Induced Electron Transfer,PET)等原理，实现简单、快速、直观检测的目标物，已在食品安全领域广泛应用[15]。曲瑶等[16]以鸟嘌呤碱基为猝灭剂，单标记荧光素的寡聚核酸为探针，基于PET原理，建立了一种荧光检测方法，但是这种方法需要筛选含有丰富鸟嘌呤碱基的适配体，无法广泛的应用于其它靶标。GUO等[17]建立了一种将无标记适配体和荧光染料结合的检测方法，由于适配体不需要标记，因此合成成本降低，但该方法需要合成纳米材料作为猝灭剂，猝灭效率不高。

本研究将适配体以荧光素(FAM)标记并作为荧光探针，Dabycl为荧光猝灭剂，基于FAM基团和猝灭基团Dabycl之间的FRET原理，建立了一种基于OTA的荧光标记检测方法。该方法具有灵敏度高、操作简单和检测快速等优点，在食品检测中具有广泛的应用前景。

1.1 仪器与试剂

G9800A荧光分光光度计，安捷伦科技有限公司；
酶标仪，美国Thermo；
台式高速离心机，德国Beckman；
pH计，美国Thermo；
恒温摇床，苏州培英实验设备有限公司；
电子分析天平，德国Sartorius；
低温冰箱，青岛海尔股份有限公司；
涡旋振荡器，上海精科实业有限公司；
纯水仪，美国Millipore。

OTA核酸适配体[18]序列(OTA-aptamer)：5′-FAM-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG GAGCATCGGACA-3′，cDNA序列：5′-CGCCACCCACACCCGATC-Dabcyl-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。OTA购自上海熹垣生物科技有限公司；
α-鹅膏毒肽标准品(α-Amanitin)购自美国Sigma公司；
呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)购自上海抚生实业有限公司；
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AF B1)购自上海吉至生化科技有限公司；
黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AF G2)购自北京百奥莱博科技有限公司；
KCl、KH2PO4、NaH2PO4、NaCl均购自天津市化学试剂三厂。

1.2 实验原理

OTA荧光标记法检测原理如图1所示，OTA-aptamer和cDNA可以通过碱基互补配对形成dsDNA。当OTA不存在时，OTA-aptamer会与cDNA不断靠近，猝灭基团Dabcyl通过FRET的原理使荧光素猝灭；
当OTA存在时，OTA-aptamer与OTA结合，与OTA-aptamer形成稳定的反平行G-四链体结构[19]，抑制cDNA与OTA-aptame杂交，荧光恢复。所以，通过监测荧光强度的变化可实现对OTA的定量检测。

图1 荧光标记法检测OTA原理示意图Fig.1 Schematic of the OTA detection based on the fluorescence labeling method

2.1 OTA-aptamer与cDNA链体积比的优化

通过优化OTA-aptamer与cDNA的体积比，确定两种基团的最适浓度。首先将OTA-aptamer和cDNA离心并用双蒸水溶解至100 μmol/L，备用。随后分别将体积比为1∶0、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8和1∶1的OTA-aptamer和cDNA同时加入至15 mL离心管中，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)补齐至3 mL，温度37 ℃、100 r/min转速条件下避光孵育30 min，然后激发波长为497 nm进行荧光检测。所有实验都设置2组平行对照。根据图2可以看出，当OTA-aptamer体积不变时，随着cDNA的体积不断增加，猝灭基团Dabcyl的浓度也不断增加，导致荧光猝灭，荧光强度逐渐下降。当体积比增大至1∶0.6时，荧光强度不再大幅度下降，为了避免猝灭基团过量给实验带来影响，选择1∶0.6为OTA-aptamer与cDNA的最优比例。

2.2 孵育时间优化

将体积比为1∶0.6的OTA-aptamer、cDNA和终浓度为200 ng/mL的OTA三者同时加入至15 mL离心管中，用PBS补齐至3 mL，分别在37 ℃恒温摇床避光孵育30 min、60 min和90 min，孵育完成后进行荧光检测。如图3所示，当孵育时间从0 min不断增加至30 min时，与无OTA的对照相比，OTA的存在对其混合溶液荧光强度的影响不断增强，当孵育时间在30～90 min时荧光增强程度反而减弱，说明孵育时间并不是越长越好，可能长时间的孵育，还会导致OTA和OTA-aptamer结合能力的降低。因此为了建立更灵敏的检测方法，选择30 min为OTA-aptamer与cDNA的最佳孵育时间。

图2 OTA-aptamer与cDNA链最佳体积比的优化Fig.2 Optimization of the volume ratio between aptamer and cDNA

图3 OTA-aptamer与cDNA孵育时间的优化Fig.3 Optimization of aptamer and cDNA incubation time

2.3 特异性分析

在上述优化的实验条件下，以OTA的结构类似物，以及可能同时存在的毒素AF B1、AF G2、DON、α-鹅膏毒肽(α-Amanitin)4种生物毒素及其混合液(不含OTA)为阴性对照，以OTA和上述4个靶标混合液(含OTA)为阳性对照，以只含有OTA-aptamer和cDNA的PBS为空白对照，对该检测方法的特异性进行分析。将终浓度为500 ng/mL的AF B1、AF G2等其他靶标及混合溶液与体积比为1∶0.6的OTA-aptamer、cDNA加入至15 mL离心管中，PBS进行稀释，终体积为3 mL，37 ℃、100 r/min转速条件下在恒温摇床上避光孵育30 min，孵育完成后进行荧光检测。由图4可知，与空白对照相比，含有OTA的溶液及含有OTA的混合溶液具有较高的荧光强度，且P<0.05，具有显著性差异，说明OTA-aptamer能特异的识别OTA，而不与其它靶标结合。

2.4 不同浓度 OTA 的检测及标准曲线的建立

分别将终浓度为0、0.01、0.025、0.05、0.15、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的OTA标准溶液，以及体积比为1∶0.6的OTA-aptamer、cDNA同时加入至离心管中，PBS(pH=7.4)补齐至3 mL。37 ℃、100 r/min条件下避光孵育30 min后，检测荧光强度。并以OTA浓度(x)为横坐标，荧光强度(y)为纵坐标，建立标准曲线。如图5所示，当OTA浓度不断增加时，越来越多的适配体与靶标OTA特异性结合并导致适配体发生构象改变，故无法与标记Dabcyl猝灭基团的cDNA链靠近，此时荧光恢复，荧光强度增强。

图4 基于适配体荧光标记法的选择性分析Fig.4 Selectivity analysis based on the fluorescence labeling methodMixture 1：AF B1、AF G2、DON、α -Amanitin；
Mixture 2：AF B1、AF G2、DON、α -Amanitin and OTA.

图5 不同浓度OTA的荧光光谱图Fig.5 Fluorescence spectra of different concentration of OTAc(a-j):0,0.01,0.025,0.05,0.15,0.2,0.25,0.5,1.0,2.0 μg/mL.

当OTA浓度在0.01～0.25 μg/mL范围内时，线性关系良好，校正曲线方程为:y=844.95x+24.14，相关系数R2为0.9991。该方法可以定量检测OTA，检测限为0.01 μg/mL，满足国标要求。

Lv等[20]利用稳定分散的金纳米颗粒(AuNPs)比聚集的AuNPs具有更好的荧光猝灭FAM基团的效果，建立了一种简单、高效的OTA检测方法，检测限22.7 nmol/L。YAN等[21]利用分子印迹技术的高选择性和上转换纳米材料的荧光特性合成了具有高选择性的荧光分子印迹聚合物用于检测OTA，此方法具有高度特异性，检测限0.031 mg/L。与之相比，本方法Dabcyl的猝灭效果更好，在特异性强的同时，灵敏度更高。

2.5 实际样品中OTA的检测

根据ELISA试剂盒步骤进行样品前处理：称取玉米粉、红薯粉各2 g于50 mL离心管中，分别向样品中加入0、0.3、0.75、1.5、3.0、6.0、7.5 μg的OTA，随后加入10 mL 70%的甲醇溶液并连续振荡5 min，混合后在室温、4 000 r/min条件下离心10 min。最后，取离心后的上清1 mL加入至1 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液并混合，用于实际样品检测。取2 mL加标后的实际样品处理液于15 mL离心管中，将终浓度为100 μmol/L、体积比为1∶0.6的OTA-aptamer和cDNA加入至样品处理液中，PBS定容至3 mL。缓慢混匀后，样品在37 ℃、100 r/min条件下避光孵育30 min，进行荧光检测。同时用ELISA进行实际样品检测，与荧光标记法比较。如图6所示，检测玉米粉和红薯粉建立的标准曲线与OTA标准品的标准曲线非常接近，其中一定的差异可能是由于基质的一定影响和样品处理中的损失。由于基质影响较小，该方法可实现对实际样品中OTA检测的目的。

图6 荧光标记法对玉米粉和红薯粉中OTA的测定Fig.6 Detection of OTA in corn flour and sweet potato flour by fluorescence labeling method

2.6 加标回收率的计算

为了更加准确地评价荧光标记法检测实际样品时的基质影响，在本实验中对玉米粉和红薯粉的加标回收率进行计算，同时用ELISA法检测实际样品的加标回收率，与本方法对比。结果如表1所示，利用ELISA法检测回收率在69.76%～88.64%之间，本文方法检测回收率在86.40%～97.50%之间。表明所建立的荧光标记法具有灵敏度高、特异性强、耗时短的特点。

表1 两种方法对实际样品中OTA的加标回收率结果

本文以Dabcyl为荧光猝灭剂，与金纳米、石墨烯等其他纳米材料相比，具有较高的猝灭效率和较低的非特异性反应，可以很大程度的提高检测方法的灵敏度和特异性。该方法以适配体为识别元件，基于FRET原理使荧光基团FAM猝灭，当OTA在0.01～0.25 μg/mL浓度范围内，OTA浓度与荧光强度呈良好的线性关系，检测限达0.01 μg/mL。与ELISA法比较，此方法的基质效应更小，操作更简单，只需30 min即可完成整个检测过程。因此，该方法可应用于实际样品中OTA的检测，并且具有较好的应用前景。

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