TIPIN分子与肝细胞癌预后的关系及其生物学作用机制

鲁睿 卫宣均 胡龙泉 张乐

作者单位：710038 西安 1空军军医大学唐都医院介入疼痛科；
110122 沈阳 2中国医科大学临床三系；
265600蓬莱 3空军94259部队卫生队

哺乳动物的昼夜生物节律现象普遍存在，包括人类在内的哺乳动物的多种生理活动，如各种肝脏合成的酶、体内激素的分泌、血压等均受昼夜节律基因调控[1]。目前，越来越多证据证实生物节律基因节律性表达的改变与包括肝癌在内的多种肿瘤发生发展关系密切[2]。Timeless（TIM）相互作用蛋白（TIM interacting protein，TIPIN）是一种与TIM相互作用的301-aa蛋白，最初在酵母中鉴定发现[3]。有研究发现节律分子TIPIN与另一生物节律分子TIM形成复合体，构成细胞复制叉复合物的一部分[3-5]，同时有助于保护细胞免受DNA损伤[6]。既往研究发现，TIPIN在黑色素瘤和三阴性乳腺癌中表达上调，敲降TIPIN表达可诱导黑色素瘤和三阴性乳腺癌细胞凋亡[7-8]。在肾癌、胰腺癌研究中也发现了TIPIN分子在肿瘤进展中的潜在功能[9-10]。但是，TIPIN在肝癌中的表达及其与肝癌进展和预后的关系仍不明确。本研究拟通过UALCAN数据库分析TIPIN在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织中的表达及其与患者预后的关系，并探究TIPIN对肝癌细胞增殖的影响及可能形成的分子调控网络。

1.1 细胞系与主要试剂

人正常肝细胞株HL7702和人肝癌细胞株HepG2、BEL-7402均购自中国科学院上海细胞库，人肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L受赠于空军军医大学第一附属医院消化病医院实验室。DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、MEM培养基、青霉素-链霉素溶液（双抗）均购自武汉普诺赛公司。LipofectamineTM2000、TRIzol试剂、PVDF膜均购自美国Invitrogen公司，siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司（siTIPIN-1：5′-UUUCAGAUAAGUUUGUCAGAAAGGG-3′；
siTIPIN-2：5"-AUUUCUGGAUGUAGCAUCAAGUUGC-3′；
siControl：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′）。胎牛血清、BCA蛋白定量试剂盒购自武汉优试生物技术有限公司。胰酶细胞消化液、细胞裂解液、Western blot封闭液、结晶紫染液、超敏ECL化学发光试剂盒均购自上海碧云天公司。PCR引物购自上海生工生物公司。反转录试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒购自MedChemExpress公司；
MTS试剂购自美国Promega公司。兔多抗TIPIN抗体、兔多抗β-actin抗体购自武汉三鹰公司。

1.2 利用UALCAN数据库分析TIPIN在HCC组织中的表达及其与患者预后的关系

在UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）中选择TCGA，通过检索TIPIN，并选择TCGA dataset分析中的“Liver hepatocellular carcinoma”获取TIPIN在正常肝组织和HCC组织中的表达数据，同时基于UALCAN数据库中患者不同的临床资料分层分析TIPIN表达与临床病理特征的关系（http：//ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/TCGAExResultNew2.pl?genenam=TIPIN&ctype=LIHC）。TCGA数据库中共包含364例HCC患者的临床数据，在R软件中采用log-rank检验分析TIPIN分子表达和患者生存数据，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

1.3 细胞培养和转染

肝癌MHCC-97H细胞、MHCC-97L细胞用含10%胎牛血清+1%双抗的DMEM培养基，肝癌HepG2细胞用含10%胎牛血清+1%双抗的MEM培养基，正常肝细胞HL7702以及肝癌BEL-7402细胞用含10%胎牛血清+1%双抗的RPMI-1640培养基，于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。

取对数生长期的MHCC-97H细胞接种于6孔板（5×105/孔）培养，待细胞融合度达80%～90%时，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行siRNA转染，分别将TIPIN的siRNA干扰片段和阴性对照siRNA转染至肝癌细胞，并记为TIPIN干扰组（siTIPIN-1组和siTIPIN-2组）和对照组（siControl组）。转染24 h后更换为DMEM新鲜培养基，继续培养48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.4 Western blot检测TIPIN蛋白的表达水平

用RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，应用BCA试剂盒检测蛋白浓度。上样蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳，恒压100 V下转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入TIPIN、β-actin一抗，4℃孵育过夜；
TBST缓冲液漂洗后，加入二抗，室温孵育2 h；
TBST缓冲液漂洗后，滴加ECL曝光显影。实验重复3次。

1.5 qRT-PCR检测TIPIN mRNA的表达水平

用TRIzol试剂提取各组细胞中的总RNA，根据Takara反转录试剂盒说明书的方法将总RNA反转录为cDNA。以cDNA作为模板，根据SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明书进行PCR扩增。PCR引物序列：TIPIN的Forward为5"-AGAATGGCGTGATTGACCTACC-3"，Reverse为5"-CCAGTGCTCCATGTGTCTGATTA-3"；
β-actin的Forward为5"-CCCAGCCATGTACGTTGCTA-3"，Reverse为5"-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3"。PCR反应条件：95 ℃ 20 s；
95 ℃ 10 s、55 ℃30 s、72 ℃ 20 s，30个循环；
72 ℃ 5 min。每个样本设3个复孔，以β-actin为内参，利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次。

1.6 MTS实验检测MHCC-97H细胞的增殖能力

转染后的各组MHCC-97H细胞经消化、吹打混匀、计数后，以1×103/孔的细胞密度接种至96孔板，每组各设5个复孔，分别于培养0 d、1 d、2 d、3 d、4 d时向每孔加入20 μL MTS试剂，继续孵育2 h，用酶标仪检测490 nm波长处的光密度（OD）值。

1.7 平板细胞克隆形成实验检测MHCC-97H细胞的增殖能力

用0.25%胰蛋白酶消化各组MHCC-97H细胞，制成细胞悬液后，显微镜下计数，按1×103/孔的细胞密度接种至6孔板，培养2周至肉眼可见细胞集落形成；
用4%多聚甲醛固定30 min，PBS摇洗3次后再用1%结晶紫染色15 min，拍照观察细胞集落形成情况并计算各组细胞克隆形成数。

1.8 TIPIN的功能富集分析

首先利用 UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）分析基因与TIPIN表达的相关性，利用生物信息学分析网站DAVID Bioinformatics Resources（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对 TIPIN进行GO功能注释和KEGG通路分析。其中GO功能注释富集分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3个方面。

1.9 TIPIN与TIM和TP53的关联分析

在 UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）中选择TCGA，通过检索TIPIN和TIM，并选择TCGA dataset分析中的Liver hepatocellular carcinoma获取TIPIN和TIM在HCC中的表达数据并Pearson相关性分析，同时基于UALCAN数据库分析TIPIN在TP53野生型和突变型患者中的表达情况（http：//ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/TCGAExResultNew2.pl?genenam=TIPIN&ctype=LIHC）。

1.10 统计学方法

使用SPSS 20.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，采用Bonferroni检验进行多重比较。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 TIPIN在HCC组织中高表达且与患者较差的预后有关

利用UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）在线分析TIPIN mRNA在HCC组织中的表达及其与患者总生存期的关系，结果发现TIPIN mRNA在HCC组织中的表达较正常肝组织明显上调（P＜0.01），见图1A。进一步分析不同细胞分化程度的HCC组织中TIPIN mRNA的表达水平，结果显示，TIPIN mRNA表达水平在不同细胞分化程度的HCC组织中均高于正常肝组织（均P＜0.01），且TIPIN mRNA在Grade 3（低分化）和Grade 4（未分化）组织中的表达水平明显高于Grade 1（高分化）和Grade 2（中等分化）组织（均P＜0.01），见图1B；
而有淋巴结转移HCC组织中TIPIN mRNA的表达水平与无淋巴结转移HCC组织相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图1C。以TIPIN表达的中位数为界值，将HCC患者分为TIPIN高表达组（n=182）和TIPIN低表达组（n=182）。Kaplan-Meier生存分析结果显示，TIPIN高表达患者的总生存期明显较TIPIN低表达患者短，差异有统计学意义（Log-rank χ2=0.037，HR=1.4，P=0.039），见图1D；
TIPIN高表达患者的无病生存期较TIPIN低表达患者短，差异有统计学意义（Log-rankχ2=0.021，HR=1.4，P=0.023），见图1E。

图1 TIPIN在HCC组织中的表达及其对患者预后的影响Fig.1 Expression level of TIPIN in HCC tissues and its effect on the prognosis of HCC patients

2.2 TIPIN在肝癌细胞中高表达

qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与正常肝细胞HL7702相比，肝癌细胞MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2、BEL-7402中TIPIN的mRNA和蛋白表达水平均明显升高（均P＜0.01），见图2。其中TIPIN在MHCC-97H细胞中的表达水平高于其余肝癌细胞（均P＜0.05），因此选择MHCC-97H细胞进行后续实验。

图2 TIPIN在正常肝细胞系与肝癌细胞系中的表达情况Fig.2 Expression of TIPIN in human normal liver cells and liver cancer cells

2.3 沉默TIPIN抑制MHCC-97H细胞增殖

qRT-PCR和Western blot检测结果显示，siTIPIN-1组和siTIPIN-2组MHCC-97H细胞中TIPIN的mRNA和蛋白表达水平均明显低于siControl组（均P＜0.01），见图3A～B。表明沉默TIPIN的MHCC-97H细胞模型构建成功。

图3 沉默TIPIN对MHCC-97H细胞增殖的影响Fig.3 Effects of silencing TIPIN on the proliferation of MHCC-97H cells

MTS实验结果显示，与siControl组相比，siTIPIN-1组和siTIPIN-2组在96 h时的细胞增殖能力明显降低（均P＜0.01），见图3C。平板细胞克隆形成实验结果显示，与siControl组相比，siTIPIN-1组和siTIPIN-2组中的细胞克隆形成能力均明显降低（均P＜0.05），见图3D。

2.4 GO和KEGG通路富集分析结果

为进一步探索TIPIN的生物学功能，本研究对TIPIN进行GO和KEGG分析。GO分析结果显示，TIPIN参与的BP主要集中在细胞分裂、DNA复制、mRNA剪接、DNA修复、细胞周期、有丝分裂姐妹染色单体分离、有丝分裂细胞周期、RNA剪接、染色体分离、有丝分裂纺锤体组织，见图4A；
在CC中主要位于细胞核质、核、动粒、细胞质基质、染色体、中心体、剪接体复合体、染色体（端粒区）、细胞质、主轴，见图4B；
MF主要富集于蛋白质结合、RNA结合、染色质结合、DNA结合、ATP酶活性、单链DNA依赖性和ATP依赖性DNA解旋酶活性、ATP结合、单链DNA结合、组蛋白结合、核酸结合，见图4C。KEGG通路分析结果显示，TIPIN主要富集于DNA复制、拼接体、细胞周期、核质转运、范可尼贫血途径、不匹配修复、同源重组、基底切除修复、核苷酸切除修复、mRNA监控途径通路，见图4D。

图4 TIPIN调控基因的GO和KEGG富集分析结果Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of TIPIN regulatory genes

2.5 TIPIN与TIM和TP53表达的相关性

TIPIN分子与TIM形成复合物构成细胞复制叉的一部分[4-5]，TIM/TIPIN复合体与细胞核分裂相关分子PCNA和RPA相互作用，调节细胞增殖[11]。结合文献及本研究的GO和KEGG富集分析结果，推测TIPIN在肝癌发挥作用可能与TIM/TIPIN复合体有关。因此，为进一步分析TIPIN在肝癌中发挥的作用与TIM/TIPIN复合体的关系，本研究基于TCGA数据库进一步检测HCC组织中TIPIN分子与TIM表达的相关性，结果显示两者表达呈明显正相关（r=0.67，P＜0.01），见图5A。考虑TP53与细胞分裂、DNA复制、mRNA剪接、DNA修复、细胞周期等调控有关，进一步基于TCGA数据库分析TIPIN在TP53突变和野生型HCC患者HCC组织中的表达情况，结果显示TIPIN在TP53突变HCC患者中的表达显著高于TP53野生型肝癌患者（P＜0.01），见图5B。

图5 TIPIN与TIM和TP53的关联分析Fig.5 Correlation analysis between TIPIN and TIM,TP53

HCC是全球癌症相关死亡的第四大原因，复发和转移率较高[12-14]。HCC的发生和进展由环境和遗传因素的相互作用共同决定，目前已发现多种关键基因和分子通路共同参与调控HCC的发生和进展，同时开发了相应的HCC靶向药物或免疫检查点抑制剂。然而，这些靶向药物或免疫检查点抑制剂仅对少数肝癌患者有效，目前仍亟需寻找新的分子标志物，开发新的靶向药物，以提高肝癌患者生存结局。生物节律基因是近年来肿瘤领域研究的新热点。研究表明生物节律基因的表达节律性在多种肿瘤中发生改变，从而导致人体内许多正常的生理活动的节律性发生变化，例如各种激素、酶、信号通路的节律性改变，进而影响肿瘤的发生和进展[15]。目前在肿瘤靶向药物探索中也涉及了部分关键节律基因，如REV-ERB/ROR，CK1和CK2等[16]。生物节律基因TIPIN位于人类染色体15q22.31，既往研究表明TIPIN在多种恶性肿瘤中差异表达，且其表达与多种恶性肿瘤的发生和进展密切相关[7-10，17]。例如，CHAKRABORTY等[7]研究发现，与正常黑色素细胞相比，TIPIN在黑色素瘤细胞中表达上调，敲低TIPIN表达可诱导黑色素瘤细胞凋亡，且TIPIN过表达的黑色素瘤患者预后较差。同样，BALDEYRON等[8]研究也发现，TIPIN在包括三阴性乳腺癌在内的乳腺癌各种亚型中高表达，但是在健康对照者的乳腺组织中几乎不表达，进一步在乳腺癌细胞中敲低TIPIN的表达，发现其细胞凋亡能力增强。CHEN等[17]通过构建整合人蛋白相互作用网络，鉴定了TIPIN、RBM15B、DUSP28和TRIM31共4个关键基因，其中TIPIN在HCC中的表达水平上调，TIPIN高表达与较差的总生存率有关，且多因素分析发现TIPIN是HCC的独立预测因子。本研究基于UALCAN数据库分析发现，TIPIN在HCC样本中的表达水平较正常肝组织明显升高，且HCC细胞分化程度越低的肝癌组织中TIPIN的表达水平越高，TIPIN高表达患者的总生存期和无复发生存期均显著低于TIPIN低表达患者，提示TIPIN高表达与HCC预后不良相关。此外，本研究还在体外细胞实验验证TIPIN在肝癌中的生物学功能，结果发现，与正常肝细胞株相比，肝癌细胞株中TIPIN表达水平明显升高，沉默TIPIN后肝癌细胞的增殖和克隆形成能力明显降低，进一步表明TIPIN在肝癌中高表达且与肝癌的恶性进展有关，TIPIN分子可能作为肝癌的治疗靶点及预后评估标志物。

TIPIN分子与TIM是细胞复制叉复合物的一部分，TIPIN和TIM以及辅助蛋白AND-1和CLASPN组成的保护复合物可稳定复制体以确保DNA的复制前进正常进行，AND-1、TIM-TIPIN和CLAPIN还可将复制叉加速大约1.9倍，剔除这4种蛋白质中的任何一种都会减少前导链产物的长度[4-5，18-19]。TIM/TIPIN复合体与细胞核分裂相关分子PCNA和RPA相互作用时还可调控细胞增殖[11，20]。本研究基于TCGA数据库对TIPIN进行GO和KEGG分析，结果发现TIPIN主要在细胞分裂、DNA复制、mRNA剪接、DNA修复、细胞周期等方面发挥调控作用；
在肝癌组织中TIPIN分子与TIM的表达呈显著正相关，提示TIPIN在肝癌中可能通过与TIPIN形成复合体来发挥其生物学作用。既往研究表明，TP53可调控肝癌细胞的分裂、DNA复制、mRNA剪接、DNA修复、细胞周期等[21]。本研究基于TCGA数据库分析也发现TP53突变肝癌患者的TIPIN表达水平显著高于TP53野生型患者，说明肝癌细胞中TIPIN的表达调控与TP53相关。但TIPIN/TIM在肝癌中的生物学功能是否与TP53功能有关尚需进一步的细胞生物学功能进行验证。

综上所述，本研究基于数据库及体外细胞实验研究发现TIPIN分子在肝癌中表达上调，且与肝癌的恶性进展有关，TIPIN相关蛋白主要富集于DNA复制、拼接体、细胞周期等通路，TIPIN在肝癌中可能通过与TIPIN形成复合体或调控TP53信号通路发挥其生物学作用，因此TIPIN具有成为HCC预后标志物和药物靶点的潜能。然而，本研究仅在细胞层面进行一部分细胞功能的探索，TIPIN确切的作用及其具体的作用机制仍有待进一步挖掘和验证。

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