‘凤丹’种子层积过程中内源抑制物含量变化规律

李 强，孙海燕，朱铭玮，翟金庭，李淑娴

（1. 南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；
2. 盐城林场，江苏 盐城 224136）

油用牡丹是芍药科Paeoniaceae芍药属PaeoniaL.多年生落叶灌木，是牡丹组植物中结实量大且出油率高（≥22%）的种的统称[1]。与其他木本油料植物相比，油用牡丹抗性强，在贫瘠的土地上也能较好地生长；
油用牡丹的耐荫性也较强，其与高大经济林植物间作，具有一次种植连续收获30年以上的特点[2]。有关研究者在检测中发现，油用牡丹的主要栽培品种群‘凤丹’P.ostii‘Feng Dan’的种子含油率较高，且其油品质也较好，种子中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸的含量高达90%[3]，特别是其中的具有“植物脑黄金”之誉的α-亚麻酸的含量高达42%以上[4]。牡丹籽中的α-亚麻酸含量明显高于常规食用油中的α-亚麻酸含量（是橄榄油的140倍），且中国作为食用植物油消费大国，自给率仅为35.3%，长期被动进口大量的植物油，而木本油料植物的开发与利用才是解决世界各国食用植物油缺口问题的重要渠道[5]，因此油用牡丹成为近年来快速发展的新兴产业，获得国家的大力扶持与推广，并于2011年获批原卫生部国家新资源食品。

生产上，油用牡丹以种子繁殖为主，而其种子具有休眠习性，需要经过近6个月的层积处理才能正常萌发，这给播种育苗工作带来诸多不便。有研究者发现，内源抑制物的存在是导致许多植物种子休眠的重要因素之一[6-7]，且这些抑制物通常存在于种皮、胚乳等部位中，其中已分离鉴定出的抑制物质主要为有机酸类、酚类、醛类和生物碱类等，如杨立学等[8]采用GC-MS技术在紫椴Tilia amurensisRupr.种子中检测出有机酸、苯酚类等物质；
也有学者认为，酯类物质的存在也会导致种子休眠[9]。丁言[10]研究发现，内源抑制物的影响可能是造成‘凤丹’种子休眠的重要原因；
朱铭玮等[11]采用气质联用的方法分析了导致‘凤丹’种子休眠的因素，结果发现，油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、邻苯二酚等5种物质可能是导致其种子休眠的重要抑制物，而他们并未研究种子在休眠解除过程中这几种物质含量的变化特点。为了探究‘凤丹’种子休眠解除过程中上述5种抑制物质的含量变化规律及其与‘凤丹’种子休眠的关系，本研究以层积处理不同阶段的‘凤丹’种子为材料，提取不同层积阶段种子的浸提液，进行生物活性测定，分析内源抑制物对‘凤丹’种子休眠的影响情况，依据抑制中浓度进一步探究抑制物质对种子休眠的影响程度，并对‘凤丹’种子整个层积过程中抑制物含量进行测定，为更好地解除种子休眠、促进种子萌发提供理论依据。

1.1 试验材料

将新采收的‘凤丹’种子（深休眠）与湿沙按1∶3的体积比混匀后放在10 ℃的温度条件下进行层积处理，待胚根突破种皮后再将其放在4 ℃低温下进行层积处理，以解除上胚轴的休眠。层积处理过程中，要定期翻动种子，以保持良好的通气条件，并注意及时补充水分。分别于层积处理0 d（Ⅰ阶段）、层积处理30 d（Ⅱ阶段）、胚根突破种皮（Ⅲ阶段）、上胚轴出现（Ⅳ阶段）、5%的种子真叶出现（Ⅴ阶段）时数取一定数量的种子以用于下面的相关试验中。

1.2 研究方法

1.2.1 层积不同阶段种子浸提液的提取及甲酯化处理

按照李婉茹等[12]的方法（略有改动）进行种子浸提液的提取与甲酯化处理。随机数取各个层积阶段的‘凤丹’种子粒数，每个层积阶段各数取种子50粒，各设3个重复，将数取的种子冻干、粉碎后，称取2 g粉末，加入100%的甲醇溶液100 mL，密闭浸提24 h后，以5 000 r/min的转速离心3 min。过滤上清液，在60 ℃下减压浓缩蒸馏，最后将浓缩液定容至5 mL。取浓缩液1 mL，加入蒸馏水稀释至20 mL以用于其生物活性的测定。

分别取上述5个层积阶段的种子浸提液，每个阶段的种子浸提液各取0.2 mL，依次加入0.5 mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液2 mL、14%的三氟化硼-甲醇溶液2 mL、正己烷2 mL、饱和氯化钠水溶液2 mL，然后静置，取甲酯化后的上清液，以用于种子中抑制物含量的测定。

1.2.2 各个层积阶段‘凤丹’种子分离物生物活性的测定

以白菜种子为材料，对上述浸提液的生物活性进行测定：每个层积阶段的‘凤丹’种子浸提液各取1 mL，分别加入铺有一层滤纸的培养皿中，待甲醇挥发后，加入蒸馏水4 mL，每个重复各随机数取白菜种子100粒，设3个重复，将白菜种子置于装有1 mL‘凤丹’种子浸提液的培养皿中浸泡3 h，以加入1 mL蒸馏水处理相同时间的为对照。再将浸泡后的白菜种子放在铺有2层滤纸的培养皿中，在25 ℃的恒温光照培养箱内进行发芽试验。当白菜种子的胚根伸长至少1 cm且子叶展开时即认为该种子已经发芽，每隔8 h统计1次白菜种子的发芽率，将种子发芽粒数连续3天均不超过1%的视为发芽结束。发芽结束后计算各个层积阶段的白菜种子发芽率。

1.2.3 5种内源抑制物质有效抑制中浓度（IC50值）的测定

根据朱铭玮等[11]采用气质联用仪鉴定的结果及其他人[13-14]的研究结果，筛选出对‘凤丹’种子发芽可能有影响的油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、邻苯二酚这5种物质，购买其标准品（德国sigma公司）。将油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸分别稀释成1、10、100、1 000、10 000 mg/L的溶液，将邻苯二酚分别稀释成0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0、10 000.0 mg/L的溶液。随机数取白菜种子100粒，设3个重复，取不同浓度的溶液4 mL浸泡白菜种子3 h，用蒸馏水处理相同时间的白菜种子为对照。浸种后将白菜种子放在铺有2层滤纸的培养皿中，在25 ℃的光照培养箱中进行发芽试验。发芽结束后，测量各处理白菜胚根的长度，按下式计算各种物质的抑制率（预试验结果表明，采用不同浓度的标准品处理白菜种子后，其对白菜种子胚根的伸长均有抑制作用，因此测定各处理白菜种子胚根的长度以确定抑制率）。

I=(C-T)/C×100%。

式中：I为抑制率（%）；
C为对照组白菜种子胚根的长度均值（mm）；
T为处理组白菜种子胚根的长度均值（mm）。以各种抑制物浓度的对数值为X，以‘凤丹’种子浸提液对白菜种子胚根生长的抑制率（I）为Y，拟合回归方程，并根据回归方程求出Log IC50，经反对数求出抑制率达到50%时该抑制物质的浓度（IC50值）。

1.2.4 各种抑制物标准曲线的绘制

采用GC-MS气相色谱-质谱联用技术测定层积过程中各种内源抑制物质含量变化趋势时，需先绘制标准曲线，即参照王浩宇等[13]的研究结果并结合上述抑制中浓度的测定结果，选取亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、邻苯二酚这4个标准品，每个标准品各称取10 mg，分别用甲醇溶液超声溶解，定容至10 mL，作为母液，参照尚旭岚[15]所用的方法，将各个标准品分别稀释成不同浓度的溶液，亚油酸和硬脂酸的稀释浓度分别为5、10、50、100 mg/L，棕榈酸的稀释浓度分别为1、2、5、10、50、100 mg/L，邻苯二酚的稀释浓度分别为10、50、100 mg/L。然后以不同稀释浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，计算各种内源抑制物质的线性回归方程和相关系数。

1.2.5 各个层积阶段‘凤丹’种子中抑制物含量的测定

将1.2.1中所述低温层积过程中不同阶段的‘凤丹’种子的提取物甲酯化处理后，送至清华大学化学分析测试中心进行GC-MS分析测定，所用仪器为美国产的Agelient 6890N/5973N GC-MS（气谱-质谱）联用仪。气相色谱条件：石英毛细管柱为TR-WAXMS（Thermo Scientific，30 m×250 μm×0.25 μm）；
参照钱存梦等[16]所用的方法测定各个层积阶段种子中抑制物的含量；
122-5532UI DB-5MS气相色谱柱（Agilent，J & W Scientific，30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度为250 ℃，载体为高纯氦气，其流量为1 mL/min，分流比为10。升温程序：50 ℃保持5 min；
以5 ℃/min升至300 ℃，保持20 min。离子源温度为220 ℃，接口温度为280 ℃，以SIM检测方法进行定量分析。

以不同稀释浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，查询相应的标准曲线，计算各个层积阶段硬脂酸、棕榈酸、亚油酸、邻苯二酚的含量。

1.3 数据处理

采用Excel和Origin 2017软件绘制图表，运用SPSS.22软件进行数据处理。

2.1 休眠解除过程中抑制物活性的测定结果

不同层积阶段‘凤丹’种子的浸提液对白菜种子发芽率的影响情况见表1。由表1可知，各个层积阶段‘凤丹’种子的浸提液对白菜种子发芽率的影响程度并不相同。Ⅰ阶段（新采收）‘凤丹’种子的浸提液使白菜种子发芽率显著下降至20.7%，与对照相比，下降了77.4%；
随着层积时间的延长，浸提液对白菜种子发芽的影响作用减弱，当层积至Ⅲ阶段即胚根突破种皮时，白菜种子的发芽率显著增加至46.3%，但与对照相比，仍下降了49.5%，说明此时‘凤丹’种子中仍然存在对白菜种子发芽具有较强抑制作用的物质；
当‘凤丹’种子层积至Ⅴ阶段即其上胚轴休眠基本解除时，白菜种子的发芽率为88.0%，与对照相比，其差异不显著，说明此时‘凤丹’种子中抑制物的活性已变得较弱了。

表1 休眠解除不同阶段的‘凤丹’种子甲醇提取物对白菜种子发芽的影响†Table 1 Effects of methanol extracts from P. ostii ‘Feng Dan’ seeds at different dormancy stages on germination percentage of cabbage seeds %

2.2 几种标准品抑制中浓度（IC50值）的测定结果

‘凤丹’种子甲醇提取物中棕榈酸的质谱图（图1）与计算机检索谱图的吻合度为96%。将棕榈酸标准品稀释成不同浓度的溶液，然后对不同浓度溶液的生物活性进行测定，结果如图2所示。

图1 ‘凤丹’种子甲醇提取物与棕榈酸的质谱图Fig. 1 MS comparison between inhibitor and palmitic acid

由图2可知，当棕榈酸的稀释浓度为1 mg/L时，棕榈酸溶液对白菜种子的发芽略有促进作用。随着棕榈酸稀释浓度的逐渐加大，其抑制作用不断增强。当棕榈酸的稀释浓度为10 000 mg/L时，对白菜种子发芽的抑制率为100%。计算得出的拟合方程为：y=3.637x2+12.57x-7.912。式中：y表示峰面积，单位为mV·s；
x表示标准品的浓度，单位为mg/L。利用上述不同浓度棕榈酸标准品拟合方程经反对数求出的IC50值为460.26 mg/L，也就是说，当棕榈酸标准品的浓度为460.26 mg/L时，其对白菜种子胚根生长的抑制率达到50%。

图2 不同稀释浓度的棕榈酸对白菜种子胚根长度的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of palmitic acid at different concentrations on the length of cabbage radicles

采用与棕榈酸标准品抑制中浓度的测定方法相同的方法，可以测得其他4种标准品的抑制中浓度，测定结果见表2。

这5个标准品中只有亚油酸的质谱图与计算机检索谱图的吻合度略低，但也达到了83%，棕榈酸、硬脂酸、邻苯二酚的质谱图与计算机检索谱图的吻合度均高达96%，说明其GC-MS的鉴定结果与标准品的相似度均较高。由各个标准品的IC50值可知，不同浓度的油酸对白菜种子的发芽均无抑制作用，故接下来没有绘制油酸的标准曲线，也没有检测层积过程中其含量变化情况。其他4种物质中，硬脂酸的IC50值最高，为972.75 mg/L，说明只有较高浓度的硬脂酸才会使白菜种子发芽受到影响；
亚油酸的IC50值为137.40 mg/L，远低于硬脂酸的IC50值，也就是说，对白菜种子发芽的抑制作用，相同浓度的亚油酸要强于相同浓度的硬脂酸；
这4种物质中，邻苯二酚的IC50值最低，为12.13 mg/L，当其浓度为1 mg/L时，邻苯二酚对白菜种子发芽的抑制率为27.24%。

2.3 几种抑制白菜种子发芽物质的标准曲线

亚油酸、棕榈酸、硬脂酸和邻苯二酚这4个标准品在所选色谱条件下的标准曲线如图3所示。将各标准品分别稀释成不同浓度，以其稀释浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，计算得到这4种物质的线性回归方程和相关系数见表3。由表3可知，4种标准品溶液的浓度与峰面积的相关性均良好，其相关系数均在0.999以上。

表2 5种标准品对白菜种子发芽的影响†Table 2 Effects of various standard substances on the germination of cabbage seeds

2.4 层积过程中‘凤丹’种子各种内源抑制物含量的动态变化

根据GC-MS分析测得的各种抑制物质在各个层积阶段的峰面积，按照表3中相应的标准曲线，可以计算出层积过程中4种抑制物质的含量，计算结果如图4所示。总的来说，随着层积时间的延长，‘凤丹’种子中4种抑制物质的含量均呈逐渐下降的变化趋势，但是，每一种抑制物质的含量变化幅度与变化规律均不相同。当胚根突破种皮（Ⅲ阶段）时，除邻苯二酚外，其他3种抑制物质的含量均显著下降，其中亚油酸的下降幅度最大，由I阶段的2 208.02 mg/L显著下降至1 370.77 mg/L，下降了37.92%。层积至Ⅲ阶段时，硬脂酸、棕榈酸的含量较其Ⅰ阶段的分别显著下降了24.36%、15.54%。之后随着层积时间的延长，这3种抑制物质的含量虽然仍均继续下降，但下降速度均明显变慢。当种子层积到Ⅴ阶段（上胚轴伸长且5%的种子真叶已展开）时，亚油酸的含量为1 430.98 mg/L，与其在Ⅲ、Ⅳ阶段的含量相比略有上升，而其含量差异均未达到显著水平，但与Ⅰ阶段（新采收）的种子相比，其含量仍下降了35.19%。层积至Ⅴ阶段时，棕榈酸的含量显著低于其在Ⅲ阶段的，较其在Ⅲ阶段的含量下降了25.14%，较其在Ⅰ阶段的含量下降了36.78%。同样，层积至Ⅴ阶段时，硬脂酸的含量较其在Ⅰ、Ⅲ阶段的含量分别显著下降了48.58%、32.02%。这4种抑制物质中，邻苯二酚的含量变化规律最明显，在前几个层积阶段，其含量基本没有变化，而在休眠解除的最后一个阶段，其含量突然降为0，与层积处理前的含量（8.21 mg/L）相比，其含量显著下降。

图3 4种抑制物质在所选色谱条件下的标准曲线Fig. 3 Standard curves of germination inhibitors under selected GC-MS conditions

表3 4种抑制物质在所选色谱条件下的回归方程Table 3 Regression equation of germination inhibitors under selected GC-MS conditions

3.1 内源抑制物质对种子萌发的影响

种子休眠是植物尤其是多年生植物在进化过程中形成的一个重要的适应性性状[17-18]。植物种类不同，造成种子休眠的原因也不相同[12,18]，其中内源抑制物的作用是造成许多植物种子休眠的主要原因[19]。Khan[20]早在1975年就曾提出了“三因子学说”，随后越来越多的内源抑制物被发现；
Kentzer[21]从白蜡树Fraxinus chinensisRoxb.的种子中分离出了抑制种子萌发的物质，其研究发现，这些抑制物质广泛存在于果皮、种皮、胚乳等部位中[22]。关于牡丹种子休眠问题的研究报道也较多：如周理平等[23]研究了紫斑牡丹P. rockii种子的浸提液对油菜和白菜种子发芽的影响情况，结果发现，浸提液会显著抑制种子的萌发，说明内源抑制物的作用是导致紫斑牡丹种子休眠的重要原因；
孙晓刚等[24]发现，‘凤丹’种子中的内源抑制物质通过阻碍种子吸水、抑制呼吸、抑制酶活性、阻碍种胚生长等而对种子萌发起到抑制作用。

图4 休眠解除不同阶段‘凤丹’种子中抑制物质含量的变化情况Fig. 4 Changes of inhibitory substances in P. ostii ‘Feng Dan’ seeds at different stages of dormancy release

层积处理是解除‘凤丹’种子休眠的重要方法，随着层积时间的延长，种子休眠变浅。研究中发现，不同层积阶段的‘凤丹’种子其甲醇分离物对白菜种子发芽有不同程度的抑制作用。层积前种子中抑制物质的活性最强，而休眠解除过程中内源抑制物的活性逐渐下降。这一结果与孙玉琴等[25]对屏边三七Panax stipuleanatus种子休眠的研究结果相同。‘凤丹’种子层积至第Ⅴ阶段时，其种子中仍然存在少量的抑制物质（白菜种子的发芽率为88.0%，较对照的发芽率略有下降），这可能因为每粒种子解除休眠的时间不尽相同，本研究将5%的种子真叶出现作为取样的最后一个阶段，此时没有萌发的种子仍然保持一定程度的浅休眠状态，因此最后阶段提取物对白菜种子的发芽仍会略有影响。层积过程中‘凤丹’种子中抑制物活性的变化情况再次表明了内源抑制物的抑制作用是致使种子休眠的重要原因。

3.2 ‘凤丹’种子内源抑制物质种类的筛选

气质联用的方法常被用来分析内源抑制物的种类。杨晓玲等[26]研究发现，酚类物质的抑制作用是造成山楂Crataegus pinnatifida种子休眠的重要原因；
王艳华等[27]研究发现，苯甲酸、棕榈酸、硬脂酸等物质是致使大山樱Prunus sargentii种子休眠的重要内源抑制物质；
张艳杰等[28]在对南方红豆杉Taxus wallichiana var.mairei种子休眠机理的研究中发现，棕榈酸、油酸、邻苯二甲酸二乙酯等物质对其种子萌发均有抑制作用。

根据朱铭玮等[11]的研究结果，结合其他植物的相关研究结果，可以初步判断，‘凤丹’种子休眠的重要内源抑制物可能是油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸和邻苯二酚。本研究仅就这5种物质对白菜种子发芽的有效抑制作用进行试验，结果发现，油酸对白菜种子发芽没有影响，而其他4种物质的抑制中浓度不同，其抑制效果由强至弱依次为邻苯二酚＞亚油酸＞棕榈酸＞硬脂酸，邻苯二酚、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸溶液抑制白菜种子发芽的中浓度分别为12.13、137.41、460.26、972.75 mg/L。

3.3 休眠解除过程中‘凤丹’种子中抑制物质含量的变化规律

研究结果表明：‘凤丹’种子在解除休眠的过程中，其种子中被检测的邻苯二酚、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸这4种内源抑制物的含量均呈逐渐下降的变化趋势。但是，每个层积阶段各种抑制物质的含量变化规律不尽相同：胚根突破种皮的Ⅲ阶段，邻苯二酚含量基本没有变化，其余3种抑制物质含量的下降幅度由大到小的顺序为：亚油酸（37.92%）＞硬脂酸（24.36%）＞棕榈酸（15.5%）。这3种抑制物质对‘凤丹’种子胚根突破种皮可能有一定程度的影响，其中亚油酸的影响最大。在其随后的层积过程中，仅有亚油酸在Ⅴ阶段的含量比其在Ⅱ、Ⅲ与Ⅳ阶段的含量略有回升，但其在Ⅱ、Ⅲ与Ⅳ阶段的含量差异不显著，其他抑制物质的含量均显著下降。层积至Ⅴ阶段时，棕榈酸、硬脂酸的含量均显著低于其在Ⅲ阶段的含量，分别下降了25.1%、32.0%。在此层积过程中，邻苯二酚在休眠解除的最后一个阶段的含量突然降为0，与其在层积处理前的含量相比，下降显著。因此，棕榈酸、硬脂酸、邻苯二酚这3种抑制物质可能是引起‘凤丹’种子上胚轴休眠的主要抑制物质。

朱铭玮等[11]对‘凤丹’种子内源抑制物的GC-MS鉴定结果表明，‘凤丹’种子中除了上述抑制物质之外，还有一些未知的抑制物未被鉴定出来，因此，仍需采用其他技术进一步研究那些未知抑制物质是否对其种子的萌发有较大的影响。另外，一些植物内源激素（如脱落酸ABA）对种子萌发也会有重要影响，但采用GC-MS技术并不能鉴定出相关激素。因此，关于植物内源激素对‘凤丹’种子萌发的影响问题还有待于进一步研究。

‘凤丹’种子休眠解除过程中其种子中的抑制物对白菜种子发芽的影响程度不断降低，当‘凤丹’种子层积至Ⅲ阶段时，白菜种子发芽率较对照的下降了49.5%；
层积至Ⅴ阶段时，浸提液对白菜种子发芽仍有较小的影响，但与对照相比其差异不显著。油酸对白菜种子发芽无抑制作用，从IC50值来看，各种抑制物质对‘凤丹’种子萌发的抑制效果的优劣顺序为：邻苯二酚＞亚油酸＞棕榈酸＞硬脂酸。‘凤丹’种子层积至胚根突破种皮的Ⅲ阶段时，其内源抑制物质含量的下降幅度的大小顺序为：亚油酸＞硬脂酸＞棕榈酸。种子层积至上胚轴出现的Ⅴ阶段时，邻苯二酚的含量降为0；
棕榈酸、硬脂酸的含量均显著降低，较其在Ⅲ阶段时的含量分别下降了25.1%、32.0%。因此，棕榈酸、硬脂酸、邻苯二酚这3种抑制物质可能是引起‘凤丹’种子上胚轴休眠的主要抑制物质。

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