多花黄精组培快繁技术优化

黄碧华

(福建省林业科技试验中心，福建 南靖 363600)

多花黄精(Polygonatumcyrtonema)系百合科黄精属多年生草本植物，集食用、药用、观赏于一身。黄精属的种和品种很多，作为中药使用的有黄精、滇黄精、多花黄精，以多花黄精品质最佳。黄精主要含多糖、低聚糖、黄酮、蒽醌、皂苷、木脂素等化合物，性平、味甘，为滋补上品，具有滋阴润燥、补肾益精、提高人体免疫力、抗衰老等功效[1-3]。随着黄精市场需求量的增长，规范化人工栽培势在必行，但黄精种苗问题成为限制人工大面积栽培的瓶颈，多年来，人工栽培黄精块茎繁殖生长慢、成活率低，限制了黄精的生产规模，而传统的种子繁殖，萌芽能力低且容易变异。因此，组培技术成为生产黄精优良种苗的有效途径，有关黄精包括多花黄精的组培快繁技术已有较多的文献报道[1-10]，但是已有研究结果得出的组培过程各种培养基的配置方案相差较大，在快繁生产上有的生根效果差甚至不可用，可能与外植体的种质材料及其取材部位、组培室条件等有关。为此，借鉴已有黄精组培快繁中各种培养基植物生长调节剂如6-BA、NAA、2，4-D、GA，TDZ 、kT等不同浓度配比的可行性和局限性，针对福建省多花黄精的种质资源及其药用特性以及组培室条件等因素，针对性开展外植体消毒及组培各个环节的培养基配置改进与优化试验，建立优化组培技术体系，为多花黄精种苗工厂化育苗生产提供技术支撑。

1.1 材料

于2020年，在福建省林业科技试验中心南靖县五板桥试验基地，选取2年生多花黄精芽眼饱满的地下茎块为外植体材料。

1.2 试验方法

各基本培养基均加入蔗糖25 g·L-1、琼脂7 g·L-1，pH值5.5～5.8。培养环境温度(25±2) ℃，前7 d进行弱光培养，7 d后进行光照培养，光照强度3000～5000 lx，光照时间10～16 h·d-1。

1.2.1 外植体污染控制方案优化试验 采用双因素完全随机区组设计，设置因素A：0.1%氯化汞、0.15%氯化汞2个水平，因素B：浸泡消毒外植体时间2、4、6、8、10、12 min共6个水平，组成12个处理组合，每处理共30个块茎。

将多花黄精地下块茎去除泥土和根系及叶片，用清水刷洗干净，切取当年生长较嫩且带芽眼的块茎长约3～5 cm，按组培常规方法用70%～75%的酒精浸泡20 s，无菌水冲洗后[1-2]，按试验方案投入相应的氯化汞溶液消毒处理。之后，将消毒后的外植体转接到诱导培养基(MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1)上进行初代诱导培养，30 d后调查记录各处理的污染、死亡情况。

1.2.2 诱导培养基优化试验 采用L9(34)正交试验设计，设因素A(基本培养基)：B5、1/2 MS和MS，因素B(6-BA)：0.5、0.8、1.6 mg·L-1，因素C(NAA)：0.3、0.6、0.9 mg·L-1，因素D(2，4-D)：0.2、0.5、1.0 mg·L-1，共9个处理组合，每处理30瓶，每瓶1个小块茎。诱导培养40 d后调查记录不定芽萌芽数。

1.2.3 增殖培养基优化试验 试验采用L9(34)正交设计，设因素A：基本培养基WPM、1/2 MS和MS 3个水平；
因素B：6-BA 0.6、1.2、2.4 mg·L-13个水平；
因素C：GA 1、2、3 mg·L-13个水平；
因素D：NAA 0、0.2、0.8 mg·L-13个水平，共9个处理组合，每处理30个带芽小块茎。培养环境温度(25±2)℃，光照强度4000～6000 lx，光照时间12～14 h·d-1。培养50 d后，观察并统计不定芽的增殖生长数[3-4]。

1.2.4 生根培养植物生长调节剂配比优化试验 采用L9(34)正交设计，设因素A：IBA 0.2、0.4、0.8 mg·L-13个水平；
因素B：NAA 0.2、0.5、1.0 mg·L-1；
因素C：AC 0、0.3、0.6 mg·L-1，共9个处理组合，每处理30个不定芽(有3～4片叶)进行生根培养试验。基本培养基均为1/2 MS，培养40 d后，记录各处理的根长情况。

1.3 数据统计分析

按公式：萌发率(%)=萌芽数量(个)/样本数量(个)×100%[1-2]，计算外植体萌发率。采用Excel 2003软件整理数据，SPSS 20.0软件对数据进行方差分析和多重比较。

2.1 氯化汞浓度及消毒时间对诱导的影响

由表1可知，外植体不同消毒处理方法，污染数量、萌芽率相差较大。方差分析结果表明，氯化汞质量分数0.10%与0.15%的消毒效果没差异(f=2.6650，P=0.1156)，即0.10%和0.15%的氯化汞都可以用来外植体消毒，但是不同消毒时间(f=22.8970**，P=0.0001)以及氯化汞浓度与消毒时间的互作效应(f=32.6630**，P=0.0001)差异达极显著水平。从消毒时间看，在氯化汞质量分数0.10%或0.15%下，外植体消毒时间在6～10 min较适宜，当消毒时间5 min时，真菌污染较严重；
而无论质量分数0.1%或0.15%的氯化汞，若处理时间超过12 min，则外植体出现发黑死苗的现象严重。整体趋势是氯化汞浓度高则消毒时间短些；
浓度低则消毒时间相应长些。对各处理组合的萌芽率进行差异性LSD多重比较表明，第5组和第10组的消毒效果最佳，即0.10%氯化汞消毒10 min或0.15%氯化汞消毒8 min，萌芽率达到40.0%～46.67%，极显著高于其它处理组合。该优化消毒方案，在诱导培养基培养20 d后，可以看到基部膨大鼓起，绿色愈伤膨大明显；
在培养时间延长至40 d，可观察到基部小芽点已经开始萌动，并分化出不定芽。

表1 外植体消毒处理试验结果

2.2 不同基本培养基及植物生长调节剂配比对诱导培养的影响

从表2看出，不同处理组合的萌芽率相差较大，其中诱导不定芽数量最多的是处理2，平均17个，平均萌芽率56.67%；
其次是处理3，平均萌芽率46.67%；
其余处理诱导的不定芽数均较少。方差分析及多重比较结果表明，各因素对诱导培养均有显著或极显著的影响(F基本培养基=4.1836*，P=0.0483；
F6-BA=10.6127**，P=0.00053；
FNAA=11.9501**，P=0.0041；
F2，4-D=6.1902*，P=0.0101)，各因素均以2水平的萌芽率最高且显著或极显著高于相应因素的其它水平。结合极差值大小判断，4个因素对多花黄精诱导萌芽的影响力的大小顺序为：6-BA>NAA>2，4-D>基本培养基，即6-BA和NAA在诱导不定芽萌芽中起了主要作用。综合上述分析结果，不定芽诱导数以处理2为最佳，即多花黄精诱导初代的最佳培养基为MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1。

表2 不同基本培养基及植物生长调节剂配比对诱导培养的影响

2.3 不同基本培养基及植物生长调节剂配比对增殖倍数的影响

由表3可知，9种处理组合都能使黄精块茎发芽生长，在细胞分裂素(6-BA)较低的情况下，以8号处理不定芽长势最好，增殖倍数达5.3，基部愈伤膨大明显、丛芽多、苗绿、健壮；
在细胞分裂素(6-BA)较高的情况，3号和6号处理的平均增殖倍数比7号、8号低；
在低浓度的NAA生长素情况下，1号、5号处理的增殖效果较差。经方差分析及多重比较结果表明，8号处理，即MS+6-BA 1.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1的增殖效果最佳，增殖倍数显著或极显著高于其它处理组合。相比之下该组合更适合多花黄精的继代增殖培养，即在适当的细胞分裂素(6-BA)和生长素(GA+NAA)的配置下，诱导的愈伤组织可分化出嫩芽，而过高的6-BA分裂素诱导的愈伤组织无法分化出不定芽，这与有关报道[11-13]一致。

表3 不同基本培养基及植物生长调节剂配比对增殖倍数的影响

2.4 不同植物生长调节剂及浓度对组培生根的影响

由表4看出，不同处理组合的生根数和生根率相差较大。以生根率为指标，方差分析及其多重比较结果表明，IBA不同水平间的生根率没有差异(FIBA=1.1312，P=0.3445)；
即IBA在0.2～0.8 mg·L-1范围内对生根没有影响。而NAA、AC在不同水平间的生根率均达显著或极显著差异水平(FNAA=20.7384，P=0.0001；
FAC=4.1902，P=0.0321)，NAA为1.0 mg·L-1时生根率最高；
AC为0.3、0.6 mg·L-1时生根率最高，且两水平间的生根率没有差异。不同处理组合间，以处理7，即1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.3 mg·L-1的生根数和生根率最高，分别为5.62条和97.62%，显著或极显著高于其它组合，是多花黄精诱导生根的最佳培养基配方。

表4 不同植物生长调节剂及浓度对生根的影响

通过多花黄精组培优化试验，建立了组培快繁技术体系：多花黄精外植体的优化消毒方案为0.15% HgCl2消毒8 min或0.10% HgCl2消毒10 min；
启动诱导的优化培养基为MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1；
最佳的增殖培养基为MS+6-BA 1.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1，继代增殖倍数达到5.3以上；
最佳的生根培养基为1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.3 mg·L-1，生根率达97.62%，平均根数为5.62条。

细胞分裂素6-BA对黄精组培苗生长具有显著影响，已有研究表明6-BA的最佳浓度为1.0～4.0 mg·L-1之间[10，15]，本研究得出多花黄精的增值培养基添加6-BA的最佳浓度为1.2 mg·L-1，与刘芳源等[11]认为6-BA最佳浓度为1.0 mg·L-1比较接近。此外，本试验认为启动诱导培养基同时添加适量的6-BA与NAA、2，4-D配合效果比刘红美等[9-12]认为6-BA与2，4-D配比以及周建金等[5、13-15]认为6-BA与NAA配比的更优，更有利于多花黄精组培苗的诱导、增值培养。

另外，在本试验及前期组培过程中还发现在生根时加入适量配比的萘乙酸和活性炭，基部的茎块明显，根系都从茎块发根，后期可以尝试在组培试验室直接把生根苗基部的茎块培养到2～3 cm，这有利于种植的成活率和节省户外的管理时间，从而降低种植养护的成本，也就是说如果能使黄精在生根的过程中地下茎同时生长，那么得到的种苗在来年的春季就可移栽入大田使其直接生长。

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