川崎病急性期相关的生物标志物研究进展

吴玉秀，张永峰

(潍坊医学院附属医院儿科，山东 潍坊 261000)

川崎病是一种主要发生在5岁以下儿童的急性、自限性、发热性血管炎。1967年日本川崎富作(Tomisaku Kawasaki)博士首先报道该病，并将其命名为川崎病[1-2]。川崎病的发病率、死亡率、临床表现、冠状动脉损伤情况、预后等存在地域和种族差异，目前对于该病的认知还十分浅显。川崎病的临床特征与许多儿童时期的传染性疾病(麻疹、猩红热、腺病毒感染等)相似，均有发热、皮疹、口腔黏膜弥漫充血、淋巴结肿大以及炎症指标升高等表现。对于川崎病患儿，尤其是不完全川崎病患儿，如不能及时早期诊治，约25%的川崎病患儿会发生冠状动脉病变，这会严重影响患儿的预后。

川崎病病程分为急性期、亚急性期和恢复期，其中急性期的特征是坏死性血管炎，以中性粒细胞和巨噬细胞浸润为主，炎症标志物升高[3]，但炎症标志物是非特异性的，在其他炎症和感染性疾病中也会升高。在川崎病的诊疗过程中，尽管炎症性生物标志物提示机体正在发生的炎症反应，但在确定性诊断中的价值有限。与其他血管炎性疾病和风湿病不同，川崎病没有可以明确诊断的特异性实验室指标、病理指标等。因而，在川崎病急性期发现与川崎病相关的生物标志物，可为川崎病早期诊断、预测疾病进程、免疫球蛋白耐药及冠状动脉后遗症倾向提供参考。现从基因、蛋白、免疫、血浆4个方面对川崎病急性期相关生物标志物予以综述，以便早期识别川崎病，更好地指导临床工作。

川崎病在亚裔人群中的发病率明显高于白种人群，这可能由生活环境或生活方式的差异导致，但也有可能由遗传易感性导致[4]。在夏威夷定居的日裔中，川崎病的发病率也较高，并与日本本土人的发病率相似[5]，提示该病可能与遗传有关。运用候选基因方法和全基因组关联研究方法，在疾病急性期识别易感基因可为川崎病的早期诊断提供帮助，同时也为寻找新的药物靶点提供依据。

1.1B淋巴酪氨酸激酶(B lymphoid tyrosine kinase,BLK)基因 BLK基因编码B细胞上的类固醇受体共激活子家族的B淋巴酪氨酸激酶，其在信号转导通路下游的几个基因中起作用。BLK基因参与了免疫球蛋白A和免疫球蛋白B的免疫受体酪氨酸激活基序残基的磷酸化，且BLK基因的突变会导致胰腺B细胞功能异常，从而导致川崎病患儿内环境紊乱[6]。Lee等[7]发现，BLK在B细胞的信号转导中发挥作用。在川崎病急性期，B细胞中的rs2736340风险等位基因参与了BLK的低表达，影响了川崎病患者B细胞的功能，增加了川崎病的易感性。此外，川崎病急性期，丙种球蛋白给药前，BLK信使RNA的表达较高，但丙种球蛋白给药后BLK信使RNA的表达降低，恢复期进一步降低[8]。以上研究表明，在未给予任何药物干预之前，川崎病急性期患儿体内BLA信使RNA高表达。BLK基因突变使得其信使RNA表达异常、B细胞功能异常，导致川崎病患儿机体代谢紊乱，增加了川崎病的基因易感性。

1.2钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1) 基因 ORAI1是一种涉及T细胞调节和炎症反应的钙离子通道蛋白。Onouchi等[9]发现，日本人群中ORAI1基因第2外显子的单核苷酸多态性(rs3741596)与川崎病具有显著的非同义关联，并伴有川崎病高风险，单核苷酸多态性会导致ORAI1的第2个胞外环中第218位的氨基酸从丝氨酸转变为甘氨酸。在后继的研究中发现，日本人群中ORAI1(rs3741596)风险等位基因频率是欧洲人的20倍，同时ORAI1基因的变异体(rs141919534)也与川崎病密切相关[10]。据报道，ORAI1基因编码的蛋白质与川崎病的易感性相关，ORAI1基因变异体影响了ORAI1基因相关蛋白质的合成与加工，进而影响了ORAI1基因编码的蛋白质，增加了川崎病的易感性[11]。以上研究表明，通过基因检测技术检测与川崎病易感性相关的基因及其变异体，可在急性期及时发现并识别川崎病，为川崎病的治疗提供帮助。

1.3胱天蛋白酶3基因 胱天蛋白酶3基因位于第4号染色体，编码胱天蛋白酶3，其是活化诱导细胞死亡的重要分子。Onouchi等[12]报道，胱天蛋白酶3基因表达的改变影响免疫效应细胞对川崎病的敏感性。研究显示，胱天蛋白酶3基因5′非翻译区的单核苷酸多态性(rs72689236)会增加欧美人群和日本人群川崎病的发生风险，在胱天蛋白酶3基因中发现的多种变异体(rs2702038、rs72689236及rs113420705)与川崎病显著关联[12-13]。此外，Wang等[14]研究表明，Ca2+/活化T细胞核因子信号中的多种遗传变异均与中国人川崎病发生风险相关，不同变体[CASP3 rs2720378、白细胞介素(interleukin，IL)-2 rs2068962和基质相互作用分子1 rs1561876]也可通过协同作用增加罹患川崎病的风险。

综上所述，通过遗传学方法鉴定出川崎病急性期易感基因，基于这些基因制订临床标准将改善川崎病的诊断灵敏度，有助于及早治疗和预防冠状动脉损伤。

随着质谱法蛋白质组学分析研究的出现，与川崎病相关的蛋白生物标志物研究取得了显著进展，尽管先前的研究希望通过基因表达早期诊断川崎病，但基于蛋白质的发现可能更容易转化为具有临床实用性的检测方法，从而帮助儿科临床医师在疾病急性期识别川崎病。

2.1N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriunetic peptide,NT-proBNP) NT-proBNP是目前研究较多的一种蛋白，主要影响心脏功能，其水平升高提示心脏容量负荷过重，心功能不全。NT-proBNP在川崎病急性期也升高，可作为川崎病急性期的生物标志物。杨芳等[15]依据患儿入院时的病程(主要分为≤7 d，8～11 d，12～21 d)、NT-proBNP的水平(截点值为300 ng/L)以及心动图检测的冠状动脉情况，对川崎病患儿(包括154例典型川崎病和102例不完全川崎病)进行比较发现，病程早期(病程≤7 d)，NT-proBNP≥300 ng/L的患儿冠状动脉损害发生率明显升高。Lin等[16]的Meta分析显示，NT-proBNP的截点值为96～260 ng/L时诊断川崎病的灵敏度为66%～98%。Reddy等[17]的研究也报道了NT-proBNP的截点值为125 ng/L时，诊断川崎病急性期的灵敏度为88%，特异度为96%。以上研究表明，川崎病急性期NT-proBNP的水平可升高，对NT-proBNP的截点值进行研究有望帮助儿科医师在疾病急性期明确诊断并进行针对性治疗。

2.2半乳糖凝集素3(galectin 3，Gal-3) Gal-3是由活化的巨噬细胞分泌的一种β半乳糖凝集素，常被用作心力衰竭的潜在生物标志物。川崎病急性期患儿体内的Gal-3水平有不同程度的升高。Hoshino等[18]的研究在矫正川崎病患儿的性别和年龄后发现，射血分数正常的川崎病患儿体内的Gal-3水平较急性期射血分数减低史川崎病患儿低。在后继的研究中发现，尽管所有患者的射血分数在治疗后恢复正常，但是Gal-3水平在初次发病后数年仍较高[19]。国内也有学者报道，川崎病患儿Gal-3水平在急性期明显升高，并随着病程的进展缓慢下降，通过检测体内Gal-3水平可帮助早期识别川崎病[20]。

2.3其他蛋白标志物 研究显示，可溶性生长刺激表达基因2蛋白、心肌肌钙蛋白、γ-谷氨酰转肽酶、丙氨酸转氨酶、血小板反应蛋白-1和血小板反应蛋白-2等的水平在川崎病急性期显著升高[21]，它们有助于为川崎病急性期相关生物标志物研究提供新方向。

Jakob等[22]采用酶联免疫吸附试验对23例川崎病急性期患者和5例康复期川崎病患者的血管内皮损伤标志物血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)参数(vWF:抗原和vWF:胶原蛋白结合活性)进行评估。通过计算vWF:抗原和vWF:胶原蛋白结合活性的比率以及对vWF多聚体结构进行分析发现，急性期vWF:抗原和vWF:胶原蛋白结合活性水平显著高于恢复期，提示vWF:抗原和vWF:胶原蛋白结合活性的比率能够早期预测川崎病的发生。Kimura等[23]使用基于质谱的蛋白质组学分析鉴定差异表达的蛋白质，研究鉴定出4种与川崎病相关的蛋白：脂多糖结合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、血管紧张素原和视黄醇结合蛋白4,其中急性期脂多糖结合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、血管紧张素原的水平显著高于恢复期，但视黄醇结合蛋白4急性期的水平较恢复期低。以上两个研究表明，对于vWF参数的全面分析可能有助于监测川崎病急性期的炎症反应，并有助于识别冠心病风险增加的患者。在急性期检测出高水平的脂多糖结合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白和血管紧张素原为预测川崎病的发生提供了依据。

3.1CD8T细胞 CD8T细胞活化后可以分化为细胞毒性T细胞，其可以抵制各种病毒的入侵以及杀灭外来的病原体。CD8T细胞及其早期活化的生物标志在川崎病急性期高表达，并与冠状动脉损伤密切相关[24-25]。Rivas等[24]对伴有冠状动脉损伤的川崎病患者的尸体进行检查后发现，CD8+T细胞优先隔绝在冠状动脉中，并引起炎症性血管炎。不仅CD8T细胞，早期T细胞活化的标志物CD69+CD8T细胞在川崎病患儿急性期也明显增加[25]。

3.2髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell,mDC) mDC来源于造血干细胞，主要发挥抗原呈递作用。mDC作为获得性免疫与固有免疫之间的桥梁，已被证实在川崎病患者中减少。在川崎病急性期，mDC的下降是受累组织的再循环或外周破坏增加所致[26]。Burns等[27]认为，只有年龄较大的儿童在整个免疫循环中有大量成熟mDC,这一特征使得川崎病患儿表现出严重的炎症反应，表现为红细胞沉降率升高，丙氨酸转氨酶、γ-谷氨酰转移酶水平升高，弥散性血管内凝血和心肌炎。以上研究表明，川崎病急性期炎症反应上调可能是由于固有免疫轴存在功能障碍导致，因此mDC能够成为早期预测川崎病的生物标志物。

3.3IL-17A IL-17A是一种主要由辅助性T细胞17产生的促炎性细胞因子，辅助性T细胞17及其产生的IL-17A通过上调其他细胞因子和基质金属蛋白酶而发挥促炎作用[28]。血清IL-17A的水平与川崎病急性期和亚急性期病情活动呈正相关，血清IL-17A水平可指导丙种球蛋白的用药[29-31]。Guo等[29]采集丙种球蛋白治疗前24 h以及丙种球蛋白治疗后3 d、21 d川崎病组患儿和发热对照组患儿的血液样本进行分析，结果显示丙种球蛋白治疗前24 h，川崎病组患儿的血浆IL-17A水平较发热对照组显著升高[(25.35±3.21) ng/L比(7.78±1.78) ng/L]，而两组患儿的IL-17A水平在丙种球蛋白治疗后3 d和21 d明显降低，说明在川崎病急性期IL-17水平较高，IL-17A可能是川崎病早期诊断最为重要的生物标志物之一。Jia等[30]的研究也发现，川崎病患儿的IL-17A水平较高。刘欣等[31]的研究同样证实，川崎病急性期及亚急性期血清IL-17A的水平均升高。

综上所述，由于免疫系统紊乱，川崎病急性期产生了大量异常的免疫细胞、化学因子等，导致血管炎的形成。

目前川崎病仅依靠临床表现诊断，血液检查和仪器检查辅助诊断，但由于川崎病是由感染性因素诱发的自身免疫性疾病，因此难以区分川崎病与感染性相关疾病，尤其是两者均伴随发热时。目前关于川崎病血浆标志物的研究很少将感染引起发热的患儿设为对照组，且大多数研究均是基于单个生物标志物来预测川崎病的发生的。使用多个生物标志物联合测定诊断川崎病较单个生物标志物测定更能早期识别川崎病，并为川崎病的早期诊断提供依据。

血浆炎症标志物种类很多，如C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、髓样相关蛋白8/14(myeloid-related protein 8/14,MRP8/14)、人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase,HNE)。CRP是一种急性期炎症蛋白，其可与微生物上的多糖结合，触发经典的补体途径，并启动先天性免疫应答[32]。CRP通常在急性感染和发热期升高[33-34]。MRP8/14被认为是多种炎症性疾病的生物标志物，包括炎性肠病和类风湿关节炎[35-37]。HNE是中性粒细胞活化的标志物。有研究报道，川崎病急性期HNE水平升高[38]。Zandstra等[32]的研究包含1个发现队列和2个独立验证队列，结果显示，在发现队列中，MRP8/14联合CRP可以区分川崎病患者(n=48)与和感染发热患者(n=105),曲线下面积为0.88；
第1个验证队列证实了MRP8/14联合CRP可区分急性期川崎病患者(n=26)与感染发热患者(n=150)，曲线下面积为0.78；
同样，MRP8/14联合CRP也可区分第2个验证队列的急性川崎病患者(n=25)和感染发热患者(n=50)，曲线下面积为0.72，当包括HNE时，曲线下面积可以提高到0.84。该研究还发现，MRP8/14、CRP、HNE联合使用时更有助于鉴别川崎病和感染发热儿童。值得注意的是，在川崎病急性期后的1、2、3个月在患儿的血液样本中仍有可能检测到HNE，且发病5年以上的有冠状动脉瘤的川崎病患儿中CRP仍然升高[33]。这表明，轻度炎症在亚临床的存在时间可能较以往认为的更长。综上，MRP8/14、CRP和HNE联合使用可能有助于区分川崎病和疑似感染。

在川崎病急性期寻找一些特异性较高且能充分应用于临床的生物标志物以帮助临床儿科医师早期识别川崎病已成为当务之急。基因标志物和免疫标志物因其复杂性很难应用于临床，基于质谱法的蛋白质组学分析对于低水平的血清蛋白质标志物检出率较低，而单个血浆标志物对川崎病预测缺少特异性和敏感性。以上提示对于川崎病急性期相关生物标志物进一步开展多中心大样本研究的必要性，以期早期识别对川崎病敏感性和特异性较高的生物标志物。

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