Keap1/Nrf2信号通路与神经退行性疾病的研究进展

许莉莉，高雅然，吕佩源,

(1.河北北方学院研究生院，河北 张家口 075000；

2.河北医科大学神经病学教研室，石家庄 050017；
3.河北省人民医院神经内科，石家庄 050051)

神经退行性疾病是指一类慢性、不可逆性、进行性的以神经元退行性病变为基础的疾病，主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)等，其病因和发病机制十分复杂，主要发病机制可能与氧化应激密切相关[1]。氧化应激是自由基及活性代谢物或活性氧的产生与通过保护机制(如抗氧化酶、抗氧化剂)消除之间的不平衡，这种不平衡可以导致细胞、组织和器官损伤，是各种病理过程的主要指征之一。核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是抗氧化防御关键因子，可增强抗氧化反应对氧化应激的表达。研究发现，脑内氧化应激增强时伴随Nrf2的表达减少，在各种神经退行性疾病中均起保护作用[2]，推测Nrf2可能是针对神经退行性疾病的潜在治疗靶点，但尚缺乏针对该病治疗的临床研究，且疗效不满意，迫切需要寻求新的有效的神经退行性疾病治疗方法。由于Nrf2可能控制、调节和维持解毒以及抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)的表达，其激活在氧化应激与神经退行性疾病的病理中起着关键作用[3]。现就Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)/Nrf2信号通路与相关神经退行性疾病的相关性予以综述，以期为相关疾病的早期发现和预防提供帮助。

Keap1/Nrf2信号通路介导的抗氧化防御系统是保护机体免受氧化应激的主要机制，该通路可以调节抗氧化剂的转录，从而保持机体内环境的稳定。Nrf2由NFE2L2基因编码，属于转录因子CNC家族，含有605个氨基酸，包含一段含有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，分布于不同组织和器官，并同时表达于不同类型细胞。通过核磁共振波谱和高分辨率晶体结构进行结构域的分析表明，Nrf2分子结构中含有7个Nrf2-ECH的同源(Nrf2-ECH homologous，Neh)功能结构域(Neh1～7)，它们主要参与调节该物质的转录活性及稳定性。Neh1是第一个保守结构域，包含3个碱性亮氨酸拉链基序，允许Nrf2与ARE序列结合。在Nrf2从Keap1释放后，Neh1结构域暴露Nrf2所需的核定位信号，从而转移到细胞核中；
此外，该结构域还可与E2泛素结合酶UbcM2相互作用调节Nrf2蛋白稳定性。Neh1和Neh2在Nrf2调节方面发挥不同的作用，Neh2是位于N端的负调节结构域，可促进Nrf2泛素化，随后蛋白酶体降解，这是Keap1-Nrf2结合增强的结果。Neh3结构域位于C端，可调节ARE基因的转录激活。Neh4及Neh5属于转录激活结构域，可与共激活cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)结合，从而促进Nrf2转录，并通过与核激素受体转录共激活因子AIB1相互作用增强Nrf2-ARE基因的表达。Neh6和Neh7结构域是Nrf2活性的负调节因子，Neh6结构域Nrf2的非Keap1依赖性降解是β-转导素重复蛋白的结合点。Neh7结构域通过与视黄酸X受体α相互作用，抑制Nrf2表达[3-4]。

Keap1含有624个氨基酸，作为Cullin-Ring E3泛素连接酶多亚基蛋白复合物的组成部分，是细胞内Nrf2的主要调控因子。Keap1作为KLHL家族成员，由N端区域、BTB结构域、C端Kelch结构域(又称IVR区域)组成。其中，BTB结构域是蛋白质-蛋白质相互作用的结构域，在体外形成异构体和同源二聚体，与Nrf2-Keap1的结合力相关；
Kelch结构域位于Keap1的C端，由6个Kelch重复序列组成，是Keap1-Nrf2的结合位点。Kelch结构域与Nrf2蛋白中的两个基序结合，分别称为ETGE基序(起“铰链”作用)和DLG基序(起“闩锁”作用)，被泛素-蛋白酶体降解，从而维持Nrf2的稳定表达。但是暴露在亲电试剂或活性氧条件下，Keap1中的半胱氨酸残基被修饰，引起多泛素的停止。“铰链”和“闩锁”的相互作用可以降低Keap1对Nrf2的亲和力，但不会导致释放[5],而新合成的Nrf2被转移到细胞核，可触发Nrf2依赖基因的转录，从而提高细胞抗氧化应激防御能力[6]。

在正常生理条件下，Nrf2通过ETGE和DLG基序与Keap1结合，激活Cullin3的E3连接酶复合物与Nrf2泛素化，随后蛋白酶体降解[7]。在氧化应激条件下，Nrf2从Keap1分离并转移到细胞核，并与小Maf(肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物)蛋白异二聚体化。ARE是Nrf2靶基因调控区的增强子序列，异二聚体通过识别ARE发挥调控转录因子的作用[3]。故Nrf2/ARE信号通路在调控参与活性氧解毒和细胞毒性中起关键作用。

活性氧的积累是导致神经退行性疾病的主要机制，若维持活性氧生成和消耗的平衡被破坏可能导致大脑稳态丧失，进而导致神经退行性疾病。目前，已在神经退行性疾病患者中检出氧化标志物水平升高以及细胞成分的破坏，Keap1/Nrf2信号通路与神经退行性疾病的发生和进展存在复杂联系，该类疾病的共同特征之一是氧化还原代谢的受损，可导致活性氧积累，影响蛋白质的结构。因此，干预Keap1/Nrf2信号通路的靶点可能为抗氧化应激提供机会，并可能预防或延缓疾病进展。

2.1Keap1/Nrf2信号通路与AD AD是一种进行性神经退行性疾病，主要表现为认知下降和记忆功能障碍，其病理学标志是来自淀粉样斑块和脑内淀粉样血管病的β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)以及异常磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结[8]，主要表现为认知功能减退和非认知性神经精神症状。AD早期阶段可出现氧化应激导致的损伤，标志物主要为蛋白质、脂质、核酸的氧化损伤。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是大脑中活性氧的主要来源，其激活介导的氧化应激造成的损伤与AD中Aβ及tau病理机制相关[9]。

随着AD患者及健康老年人年龄的增加，Nrf2水平均降低，Nrf2在维持神经元线粒体功能、突触可塑性和衰老过程的认知功能中起着重要作用。Keap1是改善AD中Nrf2缺陷和保护神经元免受损伤的有效靶点，使用Nrf2抑制剂可有效保护小鼠神经元培养物免受天然来源Aβ寡聚体的突触毒性[10]。另有研究证实，miR-592通过激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路，降低C-Keap1表达，增强Nrf2和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化还原酶1的表达，提高细胞活力，从而保护星形胶质细胞免受氧化应激的损伤[11]。

AD的病理改变主要为Aβ和异常磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结。硫胺素(维生素B1)在脑能量代谢中起着重要作用，其缺乏与痴呆的严重程度存在一定关系，苯二胺是一种合成的S-硫胺素的酰基衍生物，该物质及其代谢产物在细胞和动物水平是Nrf2的激活剂，可显著增加Nrf2依赖基因的表达，具有抗tau蛋白磷酸化和神经原纤维缠结的神经保护作用，长期使用苯二胺可有效改善认知障碍、延长寿命、防止运动神经元的死亡[12]。同时，Aβ在AD的发病机制中起着关键作用。采用Aβ25～35诱导的PC12细胞氧化损伤模型在激活Keap1/Nrf2信号通路后，血红素加氧酶-1和其他抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)、过氧化氢酶]的表达水平升高，表明Keap1/Nrf2信号通路的激活在预防或修复神经损伤方面发挥保护作用[13]。在动物以及细胞水平，激活Nrf2具有显著的抗Aβ作用以及由大脑中增强的磷酸化tau蛋白诱导的神经原纤维缠结毒性作用，可调节氧化应激酶水平、改善与记忆和认知相关的病理行为，从而有效治疗AD[14]。已有研究证实，Keap1/Nrf2信号通路的激活与AD密切相关[15]，可能是治疗AD的靶点，且可预防或改善AD，但目前还缺乏关于其临床应用的安全性和有效性研究。

2.2Keap1/Nrf2信号通路与PD PD是继AD后第二大常见的神经退行性疾病，其主要特征是位于黑质的多巴胺神经元丢失导致的多巴胺水平降低，主要临床表现包括静止震颤、肌肉僵直和运动迟缓。PD患者的大脑中存在生化和细胞异常，包括线粒体功能障碍、自由基导致的损伤、兴奋毒性和炎症等变化，其中氧化应激起关键作用。Bhattacharyya等[16]报道，血清尿酸盐水平越高，PD进展越慢，抗氧化药物可改善机体的抗氧化能力，因此抗氧化药物对PD患者具有潜在益处。PD中氧化应激指标(如丙二醛、乳酸脱氢酶)水平明显升高，而总SOD、谷胱甘肽过氧化物酶、血红素加氧酶-1、Nrf2蛋白表达明显减少[17]，推测激活Nrf2通路可以减缓氧化应激导致的损伤，从而保护神经元。

PD以蛋白质病和线粒体功能障碍为特征，大多数为病因不明的散发型和少数家族性，其病理机制为氧化应激的增加。激活Keap1/Nrf2通路可延缓PD患者的神经退行性病变进展[18]。体外研究显示，不同PD相关药物对PD模型多巴胺神经元具有保护作用，其中茶多酚通过抑制多巴胺氧化、结合、清除活性氧，调节Keap1/Nrf2抗氧化信号通路，进而保护多巴胺相关毒性[19]。Rizzi等[20]采用一种成像的方法发现，在小鼠大脑的黑质致密部区域Nrf2激活早于多巴胺能神经变性。体内外研究均证明，上调Nrf2以及通过Nrf2调节其他基因和蛋白质水平，可以减轻机体氧化应激和炎症，起到神经保护作用[21]。因此，Nrf2的激活可能是PD神经退行性病变的关键靶点，可为预防多巴胺能神经退行性病变和运动缺陷提供帮助。

Lastres-Becker等[22]利用α-突触病模型对野生型小鼠与Nrf2-/-小鼠进行的对照实验证实，Nrf2缺乏可加重PD早期的蛋白质聚集、自噬、神经元死亡和炎症反应，在细胞和动物水平上，利用富马酸二甲酯靶向Nrf2作为一种治疗策略，可通过激活Nrf2通路增强内源性脑防御机制，对抗PD相关的突触核蛋白病，从而发挥多巴胺能神经元保护作用。而另一项研究报告显示，Nrf2基因表达水平与rs35652124基因型、PD或发病年龄无关[23]。PD脑中多巴胺能神经元的进行性退化导致黑质多巴胺水平急剧下降，引发PD临床症状，其中氧化应激起关键作用，但目前尚无缓解PD进行性多巴胺神经元变性的特异性药物，Nrf2与PD发病机制的关系仍存在争议。

2.3Keap1/Nrf2信号通路与HD HD是一种常染色体显性遗传病，主要病理特征是突变的亨廷顿蛋白在胞质聚集，导致活性氧产生增多，诱导细胞毒性增加，损害神经，临床表现为运动和认知障碍、人格改变和精神障碍。对体外细胞(木犀草衍生物C6处理的HD细胞)的研究阐明，活性氧水平的降低主要与Nrf2磷酸化和Nrf2/ARE核转录活性的增强、SOD1基因和SOD活性的增加以及谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基基因和蛋白水平的升高有关[24]。在HD小鼠模型和HD患者中，一种含苯三唑的Nrf2诱导剂在激活Nrf2信号通路后与ARE结合，导致活性氧的生成显著减少[25]，故推测氧化应激中的Keap1/Nrf2信号通路在其中起着关键作用。

激活Nrf2/ARE通路以及应用膳食抗氧化剂化合物同时提高抗氧化酶的水平，可有效降低氧化应激、慢性炎症和谷氨酸的释放，延缓HD症状的出现[26]。通过设计和测试几种环肽发现，Keap1/Nrf2质子泵抑制剂可能有效治疗HD，这为临床治疗提供了重要见解[27]。激活Nrf2及下游基因可有效提供HD纹状体细胞中的抗氧化能力，证实Nrf2通路对HD细胞氧化应激的神经保护作用[28]。由于Nrf2信号对下游成分的调控，激活Nrf2在成年动物中可发挥抗氧化作用，但在老年动物中可增加机体损害[29]。此外，人参皂苷是一种人参衍生的溶血磷脂酸受体配体，可在HD体外(细胞)和体内(AAV载体感染的HD小鼠模型)通过联合或协同机制激活脱脂转化酶和Keap1/Nrf2信号通路，为HD的临床治疗提供了证据[30]。Moretti等[31]证明，激活Keap1/Nrf2通路可以保留细胞中的ATP含量和线粒体电位，以保护星形胶质细胞免受氧化应激的损伤，证实内源性抗氧化剂不受HD中枢神经系统组织中亨廷顿蛋白的损害，这为HD的治疗提供了可靠依据。由此可见，氧化应激的增加和慢性炎症是HD发病机制中的早期事件，但目前尚无有效手段来阻止或推迟HD症状的出现。

2.4Keap1/Nrf2信号通路与ALS ALS是一种进行性神经退行性疾病，其特征是脊髓前角和运动皮质的神经运动元的进行性丧失，导致骨骼肌萎缩、无力以及瘫痪。氧化应激升高是ALS脑和脊髓的主要病理过程，不均一核糖核蛋白K与编码Nrf2抗氧化转录因子的抗氧化NFE2L2转录物结合，导致Nrf2信号的下游抗氧化转录物表达增加[32]。利用蛋白质结构模型的研究已阐明，Keap1/Nrf2信号通路在抗氧化应激反应的调节中起关键作用[33]。可见，Keap1/Nrf2信号调节的氧化应激与ALS发病机制有关，干预Keap1/Nrf2信号通路的靶点可能是预防或治疗ALS的关键。

ALS发病机制仍不明确，约90%的病例为散发，10%为家族性；
在家族性病例中，20%由SOD1基因的点突变引起。给予SOD1 G93A ALS小鼠模型清除自由基的药物通过Nrf2途径激活线粒体抗氧化活性，并降低SOD1表达和活性氧水平，改善运动性能，减少脊髓运动神经元损失和相关的神经胶质反应[34]。在体外(突变人SOD1的NSC-34细胞)和体内(果蝇ALS模型)使用内源性抗氧化剂可以减少活性氧的产生，刺激Nrf2的激活可导致谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基的表达和谷胱甘肽的合成增加，可作为治疗ALS的临床候选药物[35]。Zhang等[36]证实，抗氧化剂可通过激活Nrf2/谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基通路改善运动缺陷，调节氧化还原稳态。综上，氧化应激是ALS的主要病理过程，但仍需研究评估Keap1/Nrf2信号通路对细胞蛋白酶抑制以及其他ALS相关基因突变的影响，以及激活Nrf2对预防氧化应激的影响。

近年来，氧化应激在多种疾病中发挥重要作用。Nrf2是抗氧化防御系统的关键因子，同时参与抗炎、抗衰老、改善糖脂代谢紊乱、线粒体功能等过程。在AD、PD、HD及ALS等神经退行性疾病的治疗中，激活Keap1/Nrf2通路具有神经保护作用，但该通路的纵向研究尚缺乏针对疾病表现的治疗，且相关细节尚不清楚，需进一步研究和探讨Keap1/Nrf2通路在神经退行性疾病发病过程中的作用，深入了解该通路在神经退行性疾病中的作用及作用机制，以期为疾病的预防和治疗提供新的方法和思路。

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